ゲルのしくみ
SDSはタンパク質を長さに比例した負電荷で覆うので、電場の中でタンパク質はポリアクリルアミドの網目を大きさだけに応じて移動します。ゲルは2層で、低pH・低濃度の短い濃縮ゲルが試料を薄いバンドにまとめ、その下の分離ゲルがタンパク質を分けます。
濃度を選ぶ
- 8%：約40〜200 kDa
- 10%：約20〜150 kDa
- 12%：約15〜100 kDa。一般的な選択
- 15%：約10〜70 kDa
濃縮ゲルは通常4%か5%です。
各成分の役割
- アクリルアミド/ビス：ゲルの網目を作り、濃度で穴の大きさが決まります。
- Tris-HCl：分離ゲルはpH 8.8・0.375 M、濃縮ゲルはpH 6.8・0.125 M。このpHの差で試料が濃縮されます。
- SDS：0.1%。タンパク質を変性させ、電荷を与えます。
- APSとTEMED：重合を開始させます。数分で固まり始めるので最後に加えます。
ゲルを流す
- ガラス板を組み立て、水で漏れがないか確認します。
- 分離ゲルを混ぜ、APSとTEMEDを加えて回し混ぜ、コームの歯の先端より約1.5 cm下まで流し込みます。
- 表面を平らにするためイソプロパノールか水を重層し、20〜30分置いて固めます。
- 重層液を捨て、APSとTEMEDを加えた濃縮ゲルを上に流してコームを差し込みます。
- 固まったらコームを抜き、ウェルを洗います。
重合前のアクリルアミドは神経毒です。手袋をして注意して扱ってください。
計算ツール
SDS-PAGEゲルの計算は、任意の濃度と枚数の分離ゲルと濃縮ゲルの量をすべて出します。タンパク質を同量アプライするには、タンパク質濃度の計算（A280）で試料を測ります。