タンパク質が280 nmで吸収する理由
トリプトファンとチロシンが280 nmの紫外線を吸収し、ジスルフィド結合もわずかに寄与します。含まれる量はタンパク質ごとに違うので、吸光係数もタンパク質ごとに異なり、A280の結果は使う係数の正確さで決まります。
計算式
ランベルト・ベールの法則から、濃度 (M) = A280 ÷ (ε × 光路長)です。εはM−1 cm−1単位のモル吸光係数です。分子量を掛ければmg/mLになります。簡便な方法として、1 mg/mL溶液の吸光度であるAbs 0.1%（ε ÷ 分子量）を使うと、mg/mL = A280 ÷ Abs 0.1%です。
配列から吸光係数を求める
Paceら（1995）の方法では、吸収する残基を数えます。
ε = 5,500 × Trp + 1,490 × Tyr + 125 × シスチン
シスチンはジスルフィド結合でつながったシステイン2個のことです。還元型のタンパク質ではこの項を除きます。
計算例
ウシ血清アルブミン（BSA）はε = 43,824 M−1 cm−1、分子量66,430 Daなので、Abs 0.1%は43,824 ÷ 66,430 = 0.66です。光路1 cmで0.33なら、0.33 ÷ 0.66 = 0.5 mg/mL、つまり7.5 µMです。
落とし穴
- タンパク質と同じバッファーでブランクを取る。イミダゾール、界面活性剤、一部の還元剤は280 nmで吸収します。
- 核酸の混入でA280は高くなります。純粋なタンパク質のA260/A280は約0.6で、1前後以上ならDNAやRNAの混入が疑われます。
- 凝集物は光を散乱して高めに出ます。濁ったサンプルは遠心かろ過をします。
- 測定値は0.1〜1.0程度に収め、必要なら希釈します。
- トリプトファンもチロシンもないタンパク質はこの方法で測れません。BradfordやBCA法を使います。
計算ツール
タンパク質濃度の計算（A280）は、貼り付けた配列から吸光係数を求めるか、既知の係数やAbs 0.1%を使って、mg/mLとµMを出します。一般的な式はランベルト・ベールの法則の計算で、配列からの質量はタンパク質の分子量で求められます。