A280으로 단백질 농도 측정하는 방법

단백질이 280 nm에서 흡수하는 이유

트립토판과 타이로신이 280 nm의 자외선을 흡수하고, 이황화 결합도 조금 더합니다. 그 양이 단백질마다 다르므로 단백질마다 흡광 계수가 다르고, A280 결과는 사용한 계수만큼만 정확합니다.

공식

람베르트-베르 법칙에서 농도 (M) = A280 ÷ (ε × 광로 길이)이며, ε는 M⁻¹ cm⁻¹ 단위의 몰 흡광 계수입니다. 분자량을 곱하면 mg/mL가 됩니다. 간단히 1 mg/mL 용액의 흡광도인 Abs 0.1%(ε ÷ 분자량)를 쓰면 mg/mL = A280 ÷ Abs 0.1%입니다.

서열로 흡광 계수 구하기

Pace 등(1995)의 방법은 흡수하는 잔기를 셉니다.

ε = 5,500 × Trp + 1,490 × Tyr + 125 × 시스틴

시스틴은 이황화 결합으로 이어진 시스테인 한 쌍입니다. 환원된 단백질이면 이 항을 뺍니다.

계산 예

소 혈청 알부민은 ε = 43,824 M⁻¹ cm⁻¹, 분자량 66,430 Da이므로 Abs 0.1%는 43,824 ÷ 66,430 = 0.66입니다. 1 cm 큐벳에서 0.33이 나오면 0.33 ÷ 0.66 = 0.5 mg/mL, 즉 7.5 µM입니다.

함정

• 단백질과 같은 버퍼로 블랭크를 잡습니다. 이미다졸, 계면활성제, 일부 환원제는 280 nm에서 흡수합니다.
• 핵산 오염은 A280을 높입니다. 순수한 단백질의 A260/A280은 약 0.6이며, 1 근처나 그 이상이면 DNA나 RNA가 섞였다는 신호입니다.
• 응집체는 빛을 산란시켜 값이 높게 나옵니다. 탁한 시료는 원심분리하거나 여과합니다.
• 측정값은 약 0.1~1.0 사이로 맞추고, 필요하면 희석합니다.
• 트립토판도 타이로신도 없는 단백질은 이 방법으로 잴 수 없으니 Bradford나 BCA 정량법을 씁니다.

계산기

단백질 농도 계산기는 붙여 넣은 서열로 흡광 계수를 구하거나, 알려진 계수나 Abs 0.1%를 써서 mg/mL와 µM를 구합니다. 람베르트-베르 법칙 계산기는 일반 식을 풀고, 단백질 분자량은 서열로 질량을 구합니다.