제한효소가 자르는 방식
제한효소는 저마다 짧은 서열, 대개 4~8염기의 회문 서열을 인식하고 그 안이나 옆을 자릅니다. EcoRI는 GAATTC를 인식해 두 가닥 모두 G와 A 사이를 자르므로, 네 염기 AATT가 튀어나온 말단, 즉 점착 말단이 남습니다. EcoRV는 GATATC의 한가운데를 잘라 평활 말단을 남깁니다.
어떤 효소가 자르는지 찾기
- 서열을 제한효소 요약에 붙여 넣습니다.
- 선형인지 원형인지 고릅니다. 플라스미드는 원형입니다.
- 효소 목록, 절단 횟수, 위치, 조각 길이를 확인합니다.
한 곳만 자르는 효소가 플라스미드를 여는 데 쓸 수 있는 효소입니다. 원형 분자에서는 n번 자르면 조각이 n개, 선형에서는 n + 1개가 됩니다.
서열 위에서 자리 보기
제한효소 지도는 각 절단 자리를 위에 표시한 서열을 보여 줍니다. 자리가 생각한 곳에 있는지 확인하거나, 유전자 양쪽에 있는 두 효소를 찾을 때 편리합니다.
단백질을 바꾸지 않고 자리 만들기
알맞은 자리가 없을 때는 침묵 돌연변이 1~2개로 단백질을 바꾸지 않고 자리를 만들 수 있기도 합니다. 제한 자리 만드는 변이는 암호화 서열 안에서 그렇게 할 수 있는 곳을 나열합니다. 자리 지정 돌연변이 유발이나 프라이머 설계에 바로 쓸 수 있습니다.
조각 크기 예측하기
400번 위치에 EcoRI 자리, 1,300번 위치에 BamHI 자리가 있는 4,000 bp 플라스미드를 생각해 봅시다.
- 원형, 두 효소로 자름: 1,300 − 400 = 900 bp와 4,000 − 900 = 3,100 bp.
- 원형, EcoRI로만 자름: 한 번 자르면 고리가 열려 4,000 bp 밴드 하나가 됩니다.
- 같은 서열이 선형일 때 두 효소로 자름: 400, 900, 2,700 bp.
자르지 않은 플라스미드는 젤에서 실제 크기 위치에 나타나지 않습니다. 초나선 DNA는 보통 선형보다 빨리 이동하므로, 항상 자른 시료와 비교하세요.
흔한 문제
- 자리가 있는데 잘리지 않는다. 흔히 쓰는 대장균 균주의 DNA는 Dam과 Dcm으로 메틸화되어 있어, 자리가 메틸화 서열과 겹치면 잘리지 않는 효소가 있습니다. XbaI과 ClaI이 자주 영향을 받습니다. 필요하면 dam− dcm− 균주에서 플라스미드를 키우세요.
- 밴드가 더 나온다. 효소가 너무 많거나, 반응 시간이 길거나, 반응액의 글리세롤이 5%를 넘으면 비슷한 서열까지 자르는 효소가 있습니다. 이를 스타 활성이라고 합니다. 효소 부피는 반응액의 10분의 1 이하로 유지하세요.
- PCR 산물 끝에 있는 자리가 잘리지 않는다. 많은 효소는 결합하려면 자리 바깥에 몇 염기가 더 필요합니다. 프라이머에서 자리 앞에 4~6염기를 덧붙이세요.
- 두 효소의 버퍼가 다르다. 제조사의 이중 절단 표를 확인하거나, 한 효소로 자르고 DNA를 정제한 뒤 다른 효소로 자르세요.