Restriksiyon enzimleri nasıl keser
Her enzim, çoğu zaman 4–8 bazlık bir palindrom olan kısa bir diziyi tanır ve onun içinde ya da yanında keser. EcoRI GAATTC’yi tanır ve iki zincirde de G ile A arasından keserek yapışkan uç denen dört bazlık AATT çıkıntıları bırakır. EcoRV GATATC’yi tam ortasından keser ve küt uçlar bırakır.
Hangi enzimlerin kestiğini bul
- Diziyi Kesim özetine yapıştır.
- Doğrusal ya da dairesel seç. Plazmit daireseldir.
- Enzimlerin listesini, kesim sayısını, konumları ve parça boyutlarını oku.
Bir kez kesen enzimler bir plazmiti açmak için kullanılacak olanlardır. Bir dairede n kesim n parça verir; doğrusal bir molekülde n + 1.
Bölgeleri dizi üzerinde gör
Kesim haritası diziyi her kesim bölgesi üstünde işaretli olarak yazdırır; bu, bir bölgenin düşündüğün yerde olduğunu kontrol etmeyi ya da bir genin iki yanında iki enzim bulmayı kolaylaştırır.
Proteini değiştirmeden bölge ekle
Uygun bir bölge yoksa bir iki sessiz mutasyon bazen protein aynı kalırken bir tane oluşturabilir. Kesim için mutasyon kodlayan bir dizide bu yerleri, bölgeye yönelik mutagenez için ya da bir primere tasarlamak için hazır olarak listeler.
Parçaları öngörmek
400. konumda bir EcoRI ve 1.300’de bir BamHI bölgesi olan 4.000 bp’lik bir plazmit al.
- Dairesel, ikisiyle kesilmiş: 1.300 − 400 = 900 bp ve 4.000 − 900 = 3.100 bp.
- Dairesel, yalnızca EcoRI ile kesilmiş: tek kesim daireyi tek bir 4.000 bp’lik banda açar.
- Aynı dizi doğrusal bir molekül olarak, ikisiyle kesilmiş: 400, 900 ve 2.700 bp.
Kesilmemiş plazmit jelde gerçek boyutunda yürümez: süpersarmal DNA genellikle doğrusal biçimden hızlı yürür; bu yüzden her zaman kesilmiş bir örnekle karşılaştır.
Yaygın sorunlar
- Bölge var ama enzim kesmiyor. Yaygın E. coli suşlarından gelen DNA, Dam ve Dcm tarafından metillenir ve bu, bir bölge metillenmiş bir diziyle örtüştüğünde bazı enzimleri engeller. XbaI ve ClaI çoğu zaman etkilenir. Onlara ihtiyacın varsa plazmiti dam− dcm− bir suşta çoğalt.
- Fazladan bantlar çıkıyor. Çok fazla enzim, uzun bir inkübasyon ya da tepkimede %5’ten fazla gliserol, bazı enzimlerin benzer dizileri kesmesine yol açabilir; buna yıldız aktivitesi denir. Enzim hacmini tepkimenin onda biri ya da altında tut.
- Bir PCR ürününün tam ucundaki bir bölge kesilmiyor. Birçok enzim bağlanmak için bölgenin ötesinde birkaç fazladan baza ihtiyaç duyar. Primerde bölgeden önce 4 ila 6 baz ekle.
- İki enzim farklı tampon istiyor. Tedarikçinin çift kesim tablosunu kontrol et ya da bir enzimle kes, DNA’yı temizle, sonra diğeriyle kes.