Bir kılavuzun gerektirdikleri
Yaygın SpCas9 için kılavuz, hedef DNA ile eşleşen 20 bazdır ve hedefin hemen ardından aynı iplikte bir NGG PAM gelmelidir. Cas9, PAM’in 3 baz öncesinden keser. PAM’in kendisi kılavuzun parçası değildir.
Bölgeler iki iplikte de olabilir: alt iplikteki bir NGG, üst iplikte CCN olarak görünür.
Bölgeler arasında seçim yapmak
- Konum. Bir geni devre dışı bırakmak için tüm transkriptlerin paylaştığı erken bir ekzonu hedefle; böylece çerçeve kaymaları proteini bozar. Kesin bir düzenleme için kesim, değişikliğin yaklaşık 10 bazı içinde olmalıdır.
- %40 ila 80 GC içeriği. Çok düşük GC zayıf bağlanır; çok yüksek GC başka yerlere fazla kolay bağlanabilir.
- TTTT olmasın. Üst üste dört T, çoğu kılavuz plazmitinin kullandığı U6 promotöründen transkripsiyonu sonlandırır.
- Başta bir G U6 transkripsiyonuna yardım eder; yoksa birçok protokol bir tane ekler.
Hedef dışı bölgeler
Bir kılavuz, özellikle uyumsuzluklar PAM’den uzaktayken birkaç baz farklı bölgeleri de kesebilir. Kısa listeye aldığın kılavuzları sipariş etmeden önce genom genelinde arama yapan bir araçla tüm genoma karşı kontrol et ve başka yerlerde yakın eşleşmesi olmayanları seç.
Aday bölgeleri bul
Hedef dizini CRISPR kılavuz bulucuya yapıştır. NGG ve diğer PAM’ler için iki iplikteki her bölgeyi konumu, ipliği ve GC içeriğiyle listeler. Kesimin çevresinde bir tarama kesimi planlamak için Kesim haritasını kullan.
Adım adım bir bölge
Aşağıdaki dizide iki iplikten birinde kullanılabilir bir bölge, yani önünde tam 20 bazı olan bir NGG vardır:
ATGGCTAGCAAGGAGT TCATCCGTGACCTGAAGTTC TGG TAA- Kılavuz: TCATCCGTGACCTGAAGTTC, 17–36. bazlar.
- PAM: TGG, 37–39. bazlar.
- GC içeriği: 20 bazın 10’u, %50.
- Kesim: PAM’den üç baz önce, 33. ve 34. bazlar arasında.
Klonlama için oligo sipariş etmek
Birçok Cas9 plazmiti kılavuzu, kesilmiş vektöre uyan çıkıntıları olan iki birleştirilmiş oligo olarak alır. Kılavuz T ile başlıyor; bu yüzden U6 promotörü için bir G eklenir:
İleri: 5′-CACCG TCATCCGTGACCTGAAGTTC-3′
Ters: 5′-AAAC GAACTTCAGGTCACGGATGA C-3′Ters oligo kılavuzun ters tamamlayıcısıdır ve 3′ ucundaki C eklenen G ile eşleşir.
Yaygın sorunlar
- Düşük düzenleme. Kılavuzların ne kadar iyi kestiği çok değişir. Her hedef için iki ya da üç tane sipariş et ve en iyisini tut.
- Düzenlenmiş hücreler hâlâ proteini üretiyor. 3, 6 ya da 9 bazlık indeller okuma çerçevesini korur. Birkaç klonu kontrol et ve proteinin işlevi için önemli bir ekzonda kılavuz seç.
- Düzenleme jelde görülemiyor. Küçük indeller bant boyutunu değiştirmez. Uyumsuzluk kesim tayini, PCR ürününün dizilemesi ya da kesimle yok edilen bir kesim bölgesi kullan.