Qué necesita una guía
Para la SpCas9 habitual, la guía son 20 bases que coinciden con el ADN diana, y la diana debe ir seguida directamente de un PAM NGG en la misma hebra. Cas9 corta 3 bases antes del PAM. El PAM no forma parte de la guía.
Los sitios pueden estar en cualquier hebra: un NGG en la hebra inferior aparece como CCN en la superior.
Cómo elegir entre sitios
- Posición. Para anular un gen, apunta a un exón temprano común a todos los tránscritos, para que los desplazamientos del marco alteren la proteína. Para una edición precisa, el corte debe quedar a unas 10 bases del cambio.
- Contenido en GC del 40 al 80 %. Con muy poco GC se une débilmente; con mucho, puede unirse con facilidad en otros sitios.
- Sin TTTT. Cuatro T seguidas terminan la transcripción desde el promotor U6 que usan casi todos los plásmidos de guías.
- Una G al principio ayuda a la transcripción desde U6; si no la tiene, muchos protocolos la añaden.
Efectos fuera de diana
Una guía también puede cortar sitios que difieren en pocas bases, sobre todo si los desapareamientos están lejos del PAM. Antes de pedirlas, compara tus guías preseleccionadas con todo el genoma con una herramienta de búsqueda genómica y quédate con las que no tengan coincidencias cercanas.
Encuentra sitios candidatos
Pega tu secuencia diana en el Buscador de guías CRISPR. Lista todos los sitios de ambas hebras con su posición, hebra y contenido en GC, para NGG y otros PAM. Usa el Mapa de restricción para planear una digestión de cribado alrededor del corte.