O que um guia precisa
Para a SpCas9 comum, o guia tem 20 bases que pareiam com o DNA alvo, e o alvo precisa ser seguido diretamente por um PAM NGG na mesma fita. A Cas9 corta 3 bases antes do PAM. O PAM não faz parte do guia.
Os sítios podem estar em qualquer fita: um NGG na fita de baixo aparece como CCN na de cima.
Escolhendo entre sítios
- Posição. Para nocautear um gene, mire num éxon inicial comum a todos os transcritos, para que mudanças de fase estraguem a proteína. Para uma edição precisa, o corte deve ficar a cerca de 10 bases da mudança.
- Conteúdo GC de 40 a 80%. Pouco GC liga fraco; muito GC pode ligar fácil demais em outros lugares.
- Sem TTTT. Quatro T seguidos encerram a transcrição pelo promotor U6 que a maioria dos plasmídeos de guia usa.
- Um G no início ajuda a transcrição pelo U6; se não houver, muitos protocolos acrescentam.
Off-targets
Um guia também pode cortar sítios que diferem em poucas bases, principalmente quando os erros de pareamento estão longe do PAM. Compare os guias pré-selecionados com o genoma inteiro numa ferramenta de busca genômica antes de encomendar, e fique com os que não têm sítios parecidos em outro lugar.
Encontre sítios candidatos
Cole a sequência alvo no Localizador de guias CRISPR. Ele lista todos os sítios nas duas fitas com posição, fita e conteúdo GC, para NGG e outros PAMs. Use o Mapa de restrição para planejar uma digestão de triagem em volta do corte.