가이드에 필요한 것
흔히 쓰는 SpCas9의 가이드는 표적 DNA와 일치하는 20염기이며, 표적 바로 뒤 같은 가닥에 NGG PAM이 있어야 합니다. Cas9은 PAM 3염기 앞에서 자릅니다. PAM 자체는 가이드에 포함되지 않습니다.
부위는 어느 가닥에나 있을 수 있습니다. 아래 가닥의 NGG는 위 가닥에서는 CCN으로 보입니다.
부위 고르기
- 위치. 유전자를 녹아웃하려면 모든 전사체에 공통인 앞쪽 엑손을 노려, 틀 이동으로 단백질이 망가지게 합니다. 정밀 편집이라면 절단 위치가 바꿀 곳에서 10염기 이내여야 합니다.
- GC 함량 40~80%. 너무 낮으면 결합이 약하고, 너무 높으면 다른 곳에도 쉽게 결합할 수 있습니다.
- TTTT 없음. T가 네 개 연속되면 대부분의 가이드 플라스미드가 쓰는 U6 프로모터의 전사가 멈춥니다.
- 첫 염기 G는 U6 전사를 돕습니다. 없으면 하나를 덧붙이는 프로토콜이 많습니다.
오프타깃
가이드는 몇 염기만 다른 부위도 자를 수 있고, 특히 불일치가 PAM에서 먼 경우에 그렇습니다. 주문하기 전에 후보 가이드를 유전체 전체 검색 도구로 확인하고, 다른 곳에 비슷한 일치가 없는 것을 고르세요.
후보 부위 찾기
표적 서열을 CRISPR 가이드 찾기에 붙여 넣으면 양쪽 가닥의 모든 부위가 위치, 가닥, GC 함량과 함께 나열되며 NGG 외의 PAM도 지원합니다. 절단 부위 주변의 확인용 절단은 제한 효소 지도로 계획하세요.