PCR 프라이머 설계하고 확인하는 방법

좋은 프라이머의 조건

• 길이: 18~30염기.
• GC 함량: 40~60%.
• 녹는 온도: 약 55~65 °C이고, 짝이 되는 두 가닥의 차이는 약 5 °C 이내.
• 3′ 끝: G나 C로 끝남(GC 클램프). 다만 마지막 5염기에 G와 C가 4개 이상인 것은 피합니다.
• 피할 것: 같은 염기의 연속, 프라이머 자신과 짝을 이루는 부분(헤어핀이나 프라이머 이량체), 다른 프라이머와 짝을 이루는 부분.

녹는 온도

가장 간단한 식은 A나 T 하나에 2 °C, G나 C 하나에 4 °C를 더하는 것으로, 짧은 프라이머에만 알맞습니다. 긴 프라이머는 GC 함량에 바탕을 둔 식이나 염 농도 보정 식으로, 가장 좋게는 최근접 염기쌍법으로 추정합니다. 최근접 염기쌍법은 이웃한 염기 쌍을 모두 고려하고, 프라이머 농도와 나트륨 농도도 계산에 넣습니다.

프라이머 확인하기

1. 프라이머를 한 줄에 하나씩 PCR 프라이머 분석에 붙여 넣습니다.
2. 반응액의 프라이머 농도와 나트륨 농도를 입력합니다.
3. Tm을 비교하고 헤어핀, 자기 이량체, 연속 염기, 3′ 끝에 대한 경고를 확인합니다.

산물 확인하기

PCR 산물은 정방향과 역방향 프라이머가 주형의 어디에 결합하는지 찾아 각 산물의 길이와 서열을 보여 줍니다. 쓸데없는 결합 자리가 있다면 젤을 돌리기 전에 알아챌 수 있습니다. 프라이머 지도는 여러 프라이머를 방향을 나타내는 화살표와 함께 서열 위에 그립니다.