좋은 프라이머의 조건
- 길이: 18~30염기.
- GC 함량: 40~60%.
- 녹는 온도: 약 55~65 °C이고, 짝이 되는 두 가닥의 차이는 약 5 °C 이내.
- 3′ 끝: G나 C로 끝남(GC 클램프). 다만 마지막 5염기에 G와 C가 4개 이상인 것은 피합니다.
- 피할 것: 같은 염기의 연속, 프라이머 자신과 짝을 이루는 부분(헤어핀이나 프라이머 이량체), 다른 프라이머와 짝을 이루는 부분.
녹는 온도
가장 간단한 식은 A나 T 하나에 2 °C, G나 C 하나에 4 °C를 더하는 것으로, 짧은 프라이머에만 알맞습니다. 긴 프라이머는 GC 함량에 바탕을 둔 식이나 염 농도 보정 식으로, 가장 좋게는 최근접 염기쌍법으로 추정합니다. 최근접 염기쌍법은 이웃한 염기 쌍을 모두 고려하고, 프라이머 농도와 나트륨 농도도 계산에 넣습니다.
프라이머 확인하기
- 프라이머를 한 줄에 하나씩 PCR 프라이머 분석에 붙여 넣습니다.
- 반응액의 프라이머 농도와 나트륨 농도를 입력합니다.
- Tm을 비교하고 헤어핀, 자기 이량체, 연속 염기, 3′ 끝에 대한 경고를 확인합니다.
산물 확인하기
PCR 산물은 정방향과 역방향 프라이머가 주형의 어디에 결합하는지 찾아 각 산물의 길이와 서열을 보여 줍니다. 쓸데없는 결합 자리가 있다면 젤을 돌리기 전에 알아챌 수 있습니다. 프라이머 지도는 여러 프라이머를 방향을 나타내는 화살표와 함께 서열 위에 그립니다.
프라이머 하나 점검하기
5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′을 예로 듭니다. 길이는 23염기이고 그중 10개가 G 또는 C이므로 GC 함량은 10 ÷ 23 = 43%로 40~60% 범위 안입니다. 끝이 GG인 GC 클램프이며, 마지막 다섯 염기 중 G와 C가 세 개로 일반적인 상한에 해당합니다. 간단한 2 + 4 규칙으로는 2 × 13 + 4 × 10 = 66 °C인데, 이 정도 길이의 프라이머에서는 높게 나옵니다. 염 농도 조건을 넣은 최근접 이웃 계산이 더 믿을 만합니다.
어닐링 온도
흔히 쓰는 출발점은 두 프라이머 중 낮은 Tm보다 약 3~5 °C 낮은 온도입니다. 확신이 없으면 여러 온도로 그래디언트 PCR을 돌리고 깨끗한 밴드 하나가 나오는 온도를 고르세요.
제한효소 자리 붙이기
산물을 클로닝하려면 프라이머 5′ 끝에 효소 인식 서열을 붙이고, 그 앞에 4~6개 염기를 더해 효소가 끝 가까이에서도 자를 수 있게 합니다. Tm은 주형에 결합하는 부분만으로 계산하세요. 첫 사이클에서는 꼬리 부분이 결합하지 않기 때문입니다.
자주 생기는 문제
- 산물이 없습니다. 어닐링 온도를 낮추고, 프라이머 서열을 주형과 대조하고, 주형이 들어 있는지 확인하세요.
- 밴드가 여러 개입니다. 어닐링 온도를 높이고, 프라이머가 붙을 수 있는 다른 자리를 찾아보세요.
- 100 bp 아래에 희미한 밴드가 있습니다. 대개 프라이머끼리 붙은 프라이머 다이머입니다. 3′ 끝이 상보적이지 않게 다시 설계하거나 프라이머 농도를 낮추세요.