Каким должен быть хороший праймер
- Длина: 18–30 нуклеотидов.
- GC-состав: 40–60%.
- Температура плавления: примерно 55–65 °C, причём у двух праймеров пары — в пределах около 5 °C друг от друга.
- 3′-конец: заканчивается на G или C (GC-замок), но не больше 3 G или C среди последних 5 нуклеотидов.
- Избегайте: повторов одного нуклеотида, участков, спаривающихся с самим праймером (шпильки и праймер-димеры), и участков, спаривающихся с другим праймером.
Температура плавления
Самая простая формула считает 2 °C на каждый A или T и 4 °C на каждый G или C и разумна только для коротких праймеров. Для более длинных праймеров лучше формулы на основе GC-состава с поправкой на соль, а лучше всего — метод ближайших соседей, который учитывает каждую пару соседних нуклеотидов и концентрации праймера и натрия.
Проверьте праймеры
- Вставьте праймеры, по одному на строку, в Анализ праймеров ПЦР.
- Задайте концентрации праймеров и натрия в вашей реакции.
- Сравните значения Tm и прочитайте предупреждения о шпильках, самодимерах, повторах или 3′-конце.
Проверьте продукт
Продукты ПЦР находит, где прямой и обратный праймеры связываются с матрицей, и даёт размер и последовательность каждого продукта, так что лишний сайт связывания обнаружится до того, как вы запустите гель. Карта праймеров рисует набор праймеров на последовательности стрелками, показывающими их направление.
Проверка одного праймера
Возьмём 5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′. В нём 23 основания, из них 10 G или C, так что GC-состав 10 ÷ 23 = 43%, в пределах диапазона 40–60%. Он заканчивается на GG — GC-замок, с тремя G или C в последних пяти основаниях, что обычно и есть максимум. Простое правило 2 + 4 даёт 2 × 13 + 4 × 10 = 66 °C, что для праймера такой длины завышено. Расчёт методом ближайших соседей с вашими условиями по солям надёжнее.
Температура отжига
Обычная отправная точка — примерно на 3–5 °C ниже меньшей Tm пары. Если сомневаетесь, запустите градиентную ПЦР при нескольких температурах и выберите ту, что даёт одну чистую полосу.
Добавление сайта рестрикции
Чтобы клонировать продукт, добавьте сайт фермента на 5′-конец праймера, с 4–6 дополнительными основаниями перед ним, чтобы фермент мог резать у самого конца. Tm считайте только по части, связывающейся с матрицей, потому что хвост в первых циклах не связывается.
Частые проблемы
- Нет продукта. Снизьте температуру отжига, сверьте последовательности праймеров с матрицей и убедитесь, что матрица есть.
- Несколько полос. Поднимите температуру отжига и поищите другие места, где праймеры могут связаться.
- Слабая полоса ниже 100 п. н. Обычно это праймер-димер — праймеры, соединившиеся друг с другом. Перепроектируйте, избегая комплементарных 3′-концов, или снизьте концентрацию праймеров.