Зачем нужен обратный комплемент
У ДНК две цепи, идущие в противоположных направлениях. Последовательности записывают от 5′ к 3′, поэтому другая цепь, прочитанная в собственном направлении 5′→3′, — это обратный комплемент. Он нужен, чтобы подобрать обратный праймер, прочитать ген на минус-цепи или сравнить прочтение секвенирования, полученное с противоположной цепи.
Вручную
- Замените каждый нуклеотид на парный: A ↔ T и G ↔ C.
- Прочитайте результат задом наперёд.
Для 5′-ATGCCTAG-3′ комплемент — TACGGATC, а обратный комплемент — 5′-CTAGGCAT-3′. Если развернуть без замены, получится GATCCGTA — это другая последовательность и частая ошибка.
Вырожденные коды и РНК
У кодов IUPAC тоже есть пары: R (A или G) спаривается с Y (C или T), K с M, а B, D, H и V — с V, H, D и B. S, W и N остаются как есть. В РНК место T занимает U.
В браузере
- Откройте Обратный комплемент.
- Вставьте одну последовательность или много в формате FASTA.
- Выберите обратный комплемент, обращение или комплемент. Заголовки, регистр и вырожденные коды сохраняются.
Чтобы вместо этого заменить T на U, используйте ДНК в РНК.
Дизайн обратного праймера
Обратный праймер связывается с концом нужного участка на другой цепи. Возьмите последние 18–25 оснований верхней цепи и сделайте их обратный комплемент. Если участок заканчивается на 5′-ATGGCTAGCAAGGAGGTCTTA-3′, обратный праймер — 5′-TAAGACCTCCTTGCTAGCCAT-3′.
Последовательности, равные своему обратному комплементу
Многие сайты рестрикции читаются одинаково на обеих цепях. GAATTC, сайт EcoRI, даёт комплемент CTTAAG, который, прочитанный задом наперёд, снова GAATTC. Из-за таких палиндромов сайт находится один раз, по какой бы цепи вы ни искали.
Частые проблемы
- Числа и пробелы в результате. Последовательности, скопированные из GenBank или статьи, могут нести номера позиций и пробелы. Сначала очистите их или используйте инструмент, который их игнорирует.
- Заказали комплемент, а не обратный комплемент. Праймер, заказанный как простой комплемент, читается от 3′ к 5′ и работать не будет. Всегда записывайте и заказывайте праймеры от 5′ к 3′.
- Строчные буквы. Строчные основания часто обозначают повторы или хвосты праймеров; хороший инструмент при обращении сохраняет регистр каждого основания.