रिवर्स कॉम्प्लिमेंट क्यों ज़रूरी है
DNA में दो स्ट्रैंड होते हैं जो उलटी दिशाओं में चलते हैं। सीक्वेंस 5′ से 3′ लिखे जाते हैं, इसलिए दूसरा स्ट्रैंड, जब उसकी अपनी 5′ से 3′ दिशा में पढ़ा जाए, रिवर्स कॉम्प्लिमेंट होता है। रिवर्स प्राइमर डिज़ाइन करने, माइनस स्ट्रैंड पर मौजूद जीन पढ़ने, या उलटे स्ट्रैंड से आए सीक्वेंसिंग रीड की तुलना करने के लिए इसकी ज़रूरत पड़ती है।
हाथ से निकालें
- हर बेस को उसके जोड़ीदार से बदलें: A ↔ T और G ↔ C।
- नतीजे को उलटी ओर से पढ़ें।
5′-ATGCCTAG-3′ का कॉम्प्लिमेंट TACGGATC है और रिवर्स कॉम्प्लिमेंट 5′-CTAGGCAT-3′ है। बिना कॉम्प्लिमेंट किए सिर्फ़ उलटने पर GATCCGTA मिलता है, जो अलग सीक्वेंस है और यह आम गलती है।
ऐम्बिगुइटी कोड और RNA
IUPAC कोड के भी जोड़ीदार होते हैं: R (A या G) का जोड़ा Y (C या T) है, K का M, और B, D, H, V के जोड़े V, H, D, B हैं। S, W और N वैसे ही रहते हैं। RNA में T की जगह U होता है।
ब्राउज़र में करें
- रिवर्स कॉम्प्लिमेंट खोलें।
- एक सीक्वेंस पेस्ट करें, या FASTA फ़ॉर्मेट में कई।
- रिवर्स कॉम्प्लिमेंट, रिवर्स या कॉम्प्लिमेंट चुनें। टाइटल, छोटे-बड़े अक्षर और ऐम्बिगुइटी कोड बने रहते हैं।
T को U में बदलने के लिए DNA से RNA इस्तेमाल करें।
रिवर्स प्राइमर बनाना
रिवर्स प्राइमर उस हिस्से के अंत में, दूसरे स्ट्रैंड पर जुड़ता है जिसे आप कॉपी करना चाहते हैं। ऊपरी स्ट्रैंड के आख़िरी 18 से 25 बेस लें और उनका रिवर्स कॉम्प्लीमेंट बनाएँ। अगर हिस्सा 5′-ATGGCTAGCAAGGAGGTCTTA-3′ पर ख़त्म होता है, तो रिवर्स प्राइमर 5′-TAAGACCTCCTTGCTAGCCAT-3′ है।
जो अनुक्रम ख़ुद अपना रिवर्स कॉम्प्लीमेंट हैं
कई रेस्ट्रिक्शन साइट दोनों स्ट्रैंड पर एक जैसी पढ़ी जाती हैं। EcoRI की साइट GAATTC का कॉम्प्लीमेंट CTTAAG है, जो उल्टा पढ़ने पर फिर GAATTC बनता है। ऐसे पैलिंड्रोम की वजह से कोई साइट एक ही बार दिखती है, चाहे आप कोई भी स्ट्रैंड खोजें।
आम समस्याएँ
- नतीजे में अंक और स्पेस। GenBank या किसी पेपर से कॉपी किए अनुक्रमों में स्थिति के अंक और स्पेस हो सकते हैं। पहले उन्हें हटाएँ, या ऐसा टूल इस्तेमाल करें जो उन्हें अनदेखा करे।
- रिवर्स कॉम्प्लीमेंट की जगह सिर्फ़ कॉम्प्लीमेंट ऑर्डर करना। सादे कॉम्प्लीमेंट के रूप में ऑर्डर किया गया प्राइमर 3′ से 5′ लिखा होता है और काम नहीं करेगा। प्राइमर हमेशा 5′ से 3′ लिखें और ऑर्डर करें।
- छोटे अक्षर। छोटे अक्षरों वाले बेस अक्सर दोहराव या प्राइमर की पूँछ दिखाते हैं; अच्छा टूल उल्टा करते समय हर बेस का केस बनाए रखता है।