逆相補鎖が必要な理由
DNAは互いに逆向きに走る2本の鎖でできています。配列は5′から3′の向きに書くので、もう一方の鎖を自分の5′→3′の向きに読んだものが逆相補鎖です。リバースプライマーの設計、マイナス鎖にある遺伝子の読み取り、反対の鎖から読まれたシーケンスリードとの比較に必要になります。
手で求める
- 塩基をそれぞれ相手の塩基に置き換えます: A ↔ T、G ↔ C。
- 結果を後ろから読みます。
5′-ATGCCTAG-3′の相補鎖はTACGGATC、逆相補鎖は5′-CTAGGCAT-3′です。相補にせずに逆にしただけだとGATCCGTAになり、別の配列です。よくある間違いです。
縮重コードとRNA
IUPACコードにも相手があります。R(AかG)はY(CかT)と、KはMと、B・D・H・VはそれぞれV・H・D・Bと対になります。S・W・Nは変わりません。RNAではTの代わりにUを使います。
ブラウザで変換する
- 逆相補鎖を開きます。
- 配列を1本、またはFASTA形式で複数貼り付けます。
- 逆相補鎖・逆向き・相補鎖のどれかを選びます。タイトル、大文字小文字、縮重コードはそのまま残ります。
TをUに変えるだけならDNA → RNA 変換を使います。
リバースプライマーを設計する
リバースプライマーは、増やしたい領域の末端に、反対側の鎖から結合します。上の鎖の最後の18〜25塩基を取り、逆相補配列にします。領域が 5′-ATGGCTAGCAAGGAGGTCTTA-3′ で終わるなら、リバースプライマーは 5′-TAAGACCTCCTTGCTAGCCAT-3′ です。
自分自身が逆相補になる配列
多くの制限酵素サイトは、どちらの鎖で読んでも同じです。EcoRIのサイトGAATTCの相補鎖はCTTAAGで、逆から読むとまたGAATTCになります。こうした回文配列なので、どちらの鎖を検索してもサイトは1回しか出てきません。
よくある問題
- 結果に数字や空白が混じる。GenBankや論文からコピーした配列には位置番号や空白が入っていることがあります。先に取り除くか、それを無視するツールを使ってください。
- 逆相補ではなく相補配列を注文する。単なる相補配列のまま注文したプライマーは3′→5′で書かれていて機能しません。プライマーは必ず5′→3′で書いて注文しましょう。
- 小文字。小文字の塩基は反復配列やプライマーの付加配列を表すことが多く、よいツールは反転しても各塩基の大文字・小文字を保ちます。