制限酵素の切り方
制限酵素はそれぞれ短い配列、多くは4〜8塩基の回文配列を認識し、その中か隣で切断します。EcoRIはGAATTCを認識し、両方の鎖のGとAの間で切るので、4塩基のAATTが突き出た末端、つまり付着末端が残ります。EcoRVはGATATCのちょうど真ん中で切り、平滑末端を残します。
どの酵素が切るかを調べる
- 配列を制限酵素サマリーに貼り付けます。
- 直鎖状か環状かを選びます。プラスミドは環状です。
- 酵素の一覧、切断回数、位置、断片の長さを確認します。
1か所だけ切る酵素が、プラスミドを開くのに使える酵素です。環状の分子ではn回の切断でn本の断片、直鎖状ではn + 1本になります。
配列上で部位を見る
制限酵素地図は、各切断部位を上に示した配列を表示します。部位が思っている場所にあるかを確かめたり、遺伝子の両側にある2つの酵素を探したりするのに便利です。
タンパク質を変えずに部位を作る
都合のよい部位がないときは、1〜2個のサイレント変異で、タンパク質を変えずに部位を作れることがあります。制限部位を作る変異は、コード配列の中でそれができる場所を一覧にします。部位特異的変異導入やプライマー設計にそのまま使えます。
断片の大きさを予想する
4,000 bpのプラスミドで、400番目にEcoRIサイト、1,300番目にBamHIサイトがあるとします。
- 環状で両方の酵素で切断：1,300 − 400 = 900 bp と 4,000 − 900 = 3,100 bp。
- 環状でEcoRIだけで切断：1か所の切断で環が開き、4,000 bpのバンドが1本になります。
- 同じ配列が直鎖状の場合、両方で切断：400、900、2,700 bp。
切断していないプラスミドはゲル上で本来の大きさの位置に出ません。超らせんDNAはふつう直鎖状より速く泳動するので、必ず切断したサンプルと比べましょう。
よくある問題
- サイトがあるのに切れない。一般的な大腸菌株のDNAはDamやDcmでメチル化されていて、サイトがメチル化配列と重なると切れない酵素があります。XbaIやClaIはよく影響を受けます。必要ならdam− dcm−株でプラスミドを増やしてください。
- 余分なバンドが出る。酵素の入れすぎ、長すぎる反応時間、反応液中のグリセロールが5%を超えることなどで、似た配列まで切ってしまうことがあります。これをスター活性と呼びます。酵素の量は反応液の10分の1以下にしましょう。
- PCR産物の末端にあるサイトが切れない。多くの酵素は、結合するのにサイトの外側に数塩基が必要です。プライマーのサイトの前に4〜6塩基を付け足してください。
- 2つの酵素でバッファーが違う。メーカーのダブルダイジェスト表を確認するか、片方の酵素で切ってDNAを精製してから、もう片方で切ってください。