Comment coupent les enzymes de restriction
Chaque enzyme reconnaît une courte séquence, souvent un palindrome de 4 à 8 bases, et coupe à l’intérieur ou à côté. EcoRI reconnaît GAATTC et coupe entre G et A sur les deux brins, ce qui laisse des extrémités AATT de quatre bases qui dépassent, appelées extrémités cohésives. EcoRV coupe GATATC en plein milieu et laisse des extrémités franches.
Savoir quelles enzymes coupent
- Collez la séquence dans le Résumé de restriction.
- Choisissez linéaire ou circulaire. Un plasmide est circulaire.
- Lisez la liste des enzymes, le nombre de coupures, les positions et la taille des fragments.
Les enzymes qui coupent une seule fois sont celles qui servent à ouvrir un plasmide. Sur une molécule circulaire, n coupures donnent n fragments ; sur une molécule linéaire, n + 1.
Voir les sites sur la séquence
La Carte de restriction imprime la séquence avec chaque site de coupure indiqué au-dessus, ce qui permet de vérifier facilement qu’un site est bien là où on le pense, ou de trouver deux enzymes de part et d’autre d’un gène.
Ajouter un site sans changer la protéine
S’il n’y a pas de site pratique, une ou deux mutations silencieuses peuvent parfois en créer un sans changer la protéine. Muter pour une digestion liste ces endroits dans une séquence codante, prêts pour une mutagenèse dirigée ou à intégrer dans une amorce.
Prévoir les fragments
Prenez un plasmide de 4 000 pb avec un site EcoRI en position 400 et un site BamHI en 1 300.
- Circulaire, coupé par les deux : 1 300 − 400 = 900 pb et 4 000 − 900 = 3 100 pb.
- Circulaire, coupé par EcoRI seule : une coupure ouvre le cercle en une seule bande de 4 000 pb.
- La même séquence en molécule linéaire, coupée par les deux : 400, 900 et 2 700 pb.
Un plasmide non coupé ne migre pas à sa vraie taille sur gel : l’ADN surenroulé migre en général plus vite que la forme linéaire, comparez donc toujours avec un échantillon coupé.
Problèmes fréquents
- Le site est là mais l’enzyme ne coupe pas. L’ADN des souches courantes d’E. coli est méthylé par Dam et Dcm, ce qui bloque certaines enzymes quand un site chevauche une séquence méthylée. XbaI et ClaI sont souvent touchées. Faites pousser le plasmide dans une souche dam− dcm− si vous en avez besoin.
- Des bandes en trop apparaissent. Trop d’enzyme, une incubation longue ou plus de 5 % de glycérol dans la réaction peuvent faire couper certaines enzymes à des séquences proches : c’est l’activité étoile. Limitez le volume d’enzyme à un dixième de la réaction ou moins.
- Un site tout au bout d’un produit de PCR ne coupe pas. Beaucoup d’enzymes ont besoin de quelques bases au-delà du site pour se fixer. Ajoutez 4 à 6 bases avant le site dans l’amorce.
- Deux enzymes demandent des tampons différents. Consultez le tableau de double digestion du fournisseur, ou coupez avec une enzyme, purifiez l’ADN, puis coupez avec l’autre.