Comment coupent les enzymes de restriction
Chaque enzyme reconnaît une courte séquence, souvent un palindrome de 4 à 8 bases, et coupe à l’intérieur ou à côté. EcoRI reconnaît GAATTC et coupe entre G et A sur les deux brins, ce qui laisse des extrémités AATT de quatre bases qui dépassent, appelées extrémités cohésives. EcoRV coupe GATATC en plein milieu et laisse des extrémités franches.
Savoir quelles enzymes coupent
- Collez la séquence dans le Résumé de restriction.
- Choisissez linéaire ou circulaire. Un plasmide est circulaire.
- Lisez la liste des enzymes, le nombre de coupures, les positions et la taille des fragments.
Les enzymes qui coupent une seule fois sont celles qui servent à ouvrir un plasmide. Sur une molécule circulaire, n coupures donnent n fragments ; sur une molécule linéaire, n + 1.
Voir les sites sur la séquence
La Carte de restriction imprime la séquence avec chaque site de coupure indiqué au-dessus, ce qui permet de vérifier facilement qu’un site est bien là où on le pense, ou de trouver deux enzymes de part et d’autre d’un gène.
Ajouter un site sans changer la protéine
S’il n’y a pas de site pratique, une ou deux mutations silencieuses peuvent parfois en créer un sans changer la protéine. Muter pour une digestion liste ces endroits dans une séquence codante, prêts pour une mutagenèse dirigée ou à intégrer dans une amorce.