रेस्ट्रिक्शन एंज़ाइम कैसे काटते हैं
हर एंज़ाइम एक छोटा सीक्वेंस पहचानता है, अक्सर 4 से 8 बेस का पैलिंड्रोम, और उसके अंदर या पास में काटता है। EcoRI, GAATTC पहचानता है और दोनों स्ट्रैंड पर G और A के बीच काटता है, जिससे चार बेस के AATT उभरे सिरे बचते हैं, जिन्हें स्टिकी एंड कहते हैं। EcoRV, GATATC को ठीक बीच से काटता है और ब्लंट एंड छोड़ता है।
कौन-से एंज़ाइम काटते हैं
- सीक्वेंस को रेस्ट्रिक्शन सारांश में पेस्ट करें।
- लीनियर या सर्कुलर चुनें। प्लाज़्मिड सर्कुलर होता है।
- एंज़ाइम की सूची, कट की संख्या, उनकी जगह और फ़्रैगमेंट के साइज़ पढ़ें।
जो एंज़ाइम सिर्फ़ एक बार काटते हैं, वही प्लाज़्मिड खोलने के काम आते हैं। सर्कुलर DNA में n कट से n फ़्रैगमेंट बनते हैं; लीनियर में n + 1।
सीक्वेंस पर साइट देखें
रेस्ट्रिक्शन मैप सीक्वेंस छापता है और हर कट साइट उसके ऊपर दिखाता है। इससे आसानी से जाँचा जा सकता है कि कोई साइट वहीं है जहाँ आप सोचते हैं, या किसी जीन के दोनों ओर दो एंज़ाइम ढूँढे जा सकते हैं।
प्रोटीन बदले बिना साइट जोड़ें
अगर सुविधाजनक साइट न हो, तो कभी-कभी एक या दो साइलेंट म्यूटेशन से साइट बन जाती है और प्रोटीन वही रहता है। डाइजेस्ट के लिए उत्परिवर्तन कोडिंग सीक्वेंस में ऐसी जगहें बताता है, जिन्हें साइट-डायरेक्टेड म्यूटाजेनेसिस या प्राइमर में इस्तेमाल किया जा सकता है।
टुकड़ों का अनुमान
4,000 bp का एक प्लाज़्मिड लें जिसमें स्थिति 400 पर EcoRI साइट और 1,300 पर BamHI साइट है।
- गोलाकार, दोनों से कटा: 1,300 − 400 = 900 bp और 4,000 − 900 = 3,100 bp।
- गोलाकार, सिर्फ़ EcoRI से कटा: एक कट घेरे को खोलकर 4,000 bp का एक ही बैंड देता है।
- वही अनुक्रम रैखिक अणु के रूप में, दोनों से कटा: 400, 900 और 2,700 bp।
बिना कटा प्लाज़्मिड जेल पर अपने असली साइज़ पर नहीं चलता: सुपरकॉइल DNA आमतौर पर रैखिक रूप से तेज़ चलता है, इसलिए हमेशा कटे सैंपल से तुलना करें।
आम समस्याएँ
- साइट मौजूद है, पर एंज़ाइम नहीं काटता। आम E. coli स्ट्रेन का DNA Dam और Dcm से मेथिलेटेड होता है, जो कुछ एंज़ाइम को रोक देता है जब साइट किसी मेथिलेटेड अनुक्रम पर चढ़ी हो। XbaI और ClaI अक्सर प्रभावित होते हैं। ज़रूरत हो तो प्लाज़्मिड को dam− dcm− स्ट्रेन में उगाएँ।
- फ़ालतू बैंड दिखते हैं। ज़्यादा एंज़ाइम, लंबा इन्क्यूबेशन या रिएक्शन में 5% से ज़्यादा ग्लिसरॉल कुछ एंज़ाइम को मिलते-जुलते अनुक्रम पर भी कटवा सकता है, जिसे स्टार एक्टिविटी कहते हैं। एंज़ाइम की मात्रा रिएक्शन के दसवें हिस्से या उससे कम रखें।
- PCR उत्पाद के बिल्कुल सिरे की साइट नहीं कटती। कई एंज़ाइम को जुड़ने के लिए साइट से आगे कुछ अतिरिक्त बेस चाहिए। प्राइमर में साइट से पहले 4 से 6 बेस जोड़ें।
- दो एंज़ाइम को अलग बफ़र चाहिए। सप्लायर की डबल-डाइजेस्ट तालिका देखें, या एक एंज़ाइम से काटें, DNA साफ़ करें, फिर दूसरे से काटें।