Cómo cortan las enzimas de restricción
Cada enzima reconoce una secuencia corta, a menudo un palíndromo de 4 a 8 bases, y corta dentro o al lado. EcoRI reconoce GAATTC y corta entre G y A en las dos hebras, dejando extremos AATT de cuatro bases que sobresalen, llamados extremos cohesivos. EcoRV corta GATATC justo por el medio y deja extremos romos.
Saber qué enzimas cortan
- Pega la secuencia en el Resumen de restricción.
- Elige lineal o circular. Un plásmido es circular.
- Lee la lista de enzimas, el número de cortes, las posiciones y los tamaños de los fragmentos.
Las enzimas que cortan una sola vez son las que sirven para abrir un plásmido. En una molécula circular, n cortes dan n fragmentos; en una lineal dan n + 1.
Ver los sitios sobre la secuencia
El Mapa de restricción imprime la secuencia con cada sitio de corte marcado encima, lo que facilita comprobar que un sitio está donde crees o encontrar dos enzimas a ambos lados de un gen.
Añadir un sitio sin cambiar la proteína
Si no hay un sitio cómodo, una o dos mutaciones silenciosas a veces pueden crear uno sin cambiar la proteína. Mutar para digestión lista esos puntos en una secuencia codificante, listos para una mutagénesis dirigida o para incluirlos en un cebador.
Predecir los fragmentos
Toma un plásmido de 4.000 pb con un sitio EcoRI en la posición 400 y un sitio BamHI en la 1.300.
- Circular, cortado con ambas: 1.300 − 400 = 900 pb y 4.000 − 900 = 3.100 pb.
- Circular, cortado solo con EcoRI: un corte abre el círculo en una sola banda de 4.000 pb.
- La misma secuencia como molécula lineal, cortada con ambas: 400, 900 y 2.700 pb.
El plásmido sin cortar no corre según su tamaño real en un gel: el ADN superenrollado suele correr más rápido que la forma lineal, así que compáralo siempre con una muestra cortada.
Problemas frecuentes
- El sitio está, pero la enzima no corta. El ADN de las cepas habituales de E. coli está metilado por Dam y Dcm, lo que bloquea algunas enzimas cuando el sitio se solapa con una secuencia metilada. XbaI y ClaI suelen verse afectadas. Si las necesitas, propaga el plásmido en una cepa dam− dcm−.
- Aparecen bandas de más. Demasiada enzima, una incubación larga o más de un 5 % de glicerol en la reacción pueden hacer que algunas enzimas corten secuencias parecidas, la llamada actividad estrella. Mantén el volumen de enzima en una décima parte de la reacción o menos.
- Un sitio en el extremo de un producto de PCR no corta. Muchas enzimas necesitan unas bases extra más allá del sitio para unirse. Añade de 4 a 6 bases antes del sitio en el cebador.
- Dos enzimas necesitan tampones distintos. Consulta la tabla de doble digestión del proveedor, o corta con una enzima, limpia el ADN y corta después con la otra.