Cómo cortan las enzimas de restricción
Cada enzima reconoce una secuencia corta, a menudo un palíndromo de 4 a 8 bases, y corta dentro o al lado. EcoRI reconoce GAATTC y corta entre G y A en las dos hebras, dejando extremos AATT de cuatro bases que sobresalen, llamados extremos cohesivos. EcoRV corta GATATC justo por el medio y deja extremos romos.
Saber qué enzimas cortan
- Pega la secuencia en el Resumen de restricción.
- Elige lineal o circular. Un plásmido es circular.
- Lee la lista de enzimas, el número de cortes, las posiciones y los tamaños de los fragmentos.
Las enzimas que cortan una sola vez son las que sirven para abrir un plásmido. En una molécula circular, n cortes dan n fragmentos; en una lineal dan n + 1.
Ver los sitios sobre la secuencia
El Mapa de restricción imprime la secuencia con cada sitio de corte marcado encima, lo que facilita comprobar que un sitio está donde crees o encontrar dos enzimas a ambos lados de un gen.
Añadir un sitio sin cambiar la proteína
Si no hay un sitio cómodo, una o dos mutaciones silenciosas a veces pueden crear uno sin cambiar la proteína. Mutar para digestión lista esos puntos en una secuencia codificante, listos para una mutagénesis dirigida o para incluirlos en un cebador.