Cómo calcular la concentración de ADN a partir de la A260

De la absorbancia a la concentración

Los ácidos nucleicos absorben luz ultravioleta a 260 nm. Con un paso óptico de 1 cm, una A260 de 1,0 corresponde aproximadamente a:

• 50 ng/µL de ADN de doble cadena
• 40 ng/µL de ARN
• 33 ng/µL de ADN de cadena sencilla

Concentración = A260 × factor × dilución. Una muestra diluida 1:10 que da 0,25 contiene 0,25 × 50 × 10 = 125 ng/µL de ADN de doble cadena. Las lecturas son más fiables entre 0,1 y 1,0 aproximadamente; diluye las muestras más concentradas. Los oligos cortos varían más según su composición de bases, así que es mejor calcularlos con su propio coeficiente de extinción.

Relaciones de pureza

• A260/280 de alrededor de 1,8 para el ADN y 2,0 para el ARN. Valores más bajos apuntan a proteínas o fenol.
• A260/230 de alrededor de 2,0 a 2,2. Valores más bajos apuntan a sales de guanidina, EDTA o carbohidratos que quedaron de la purificación.

De ng a copias

Para los estándares de qPCR necesitas el número de moléculas. Un par de bases de ADN de doble cadena pesa unos 618 g/mol, así que 1 ng de un plásmido de 3000 pb son unas 3,2 × 10⁸ copias.

Calculadoras

La Calculadora de concentración de ADN toma tus lecturas y la dilución y comprueba las relaciones. La Calculadora de número de copias de ADN pasa de ng a copias y al revés. Para otras moléculas, la Calculadora de la ley de Beer-Lambert trabaja con el coeficiente de extinción.

El número de copias, paso a paso

Copias = masa en gramos × 6,022 × 10²³ ÷ (longitud en pb × 618). Para 1 ng de un plásmido de 3.000 pb: 1 × 10⁻⁹ × 6,022 × 10²³ ÷ (3.000 × 618) = 6,022 × 10¹⁴ ÷ 1.854.000 = 3,25 × 10⁸ copias. Algunos protocolos usan 650 g/mol por par de bases, lo que da un 5 % menos.

Pipetear una cantidad fija

Para poner 100 ng en una reacción desde un stock de 125 ng/µL hacen falta 100 ÷ 125 = 0,8 µL, demasiado poco para pipetear con precisión. Diluye antes el stock 1:10 hasta 12,5 ng/µL y añade 8 µL.

Problemas frecuentes

• La lectura de ADN sale demasiado alta. El ARN también absorbe a 260 nm, así que una preparación de ADN con ARN da lecturas altas. Trata con RNasa, o usa un ensayo con colorante que solo detecte ADN.
• La relación 260/280 es baja con ADN limpio. El agua sin tampón es ligeramente ácida y puede bajar la relación entre 0,2 y 0,3. Diluye y haz el blanco en un tampón como TE.
• Las lecturas saltan de una gota a otra. Mezcla la muestra antes de medir, limpia los dos pedestales y vigila las burbujas en los equipos de microvolumen.
• Una lectura negativa o minúscula. El blanco se hizo con un tampón distinto al de la muestra, o la muestra está por debajo del rango útil del equipo.