Cara Menghitung Konsentrasi DNA dari A260

Dari absorbansi ke konsentrasi

Asam nukleat menyerap sinar ultraviolet pada 260 nm. Dengan jalur cahaya 1 cm, A260 sebesar 1,0 setara dengan kira-kira:

• 50 ng/µL DNA untai ganda
• 40 ng/µL RNA
• 33 ng/µL DNA untai tunggal

Konsentrasi = A260 × faktor × pengenceran. Sampel yang diencerkan 1:10 dan terbaca 0,25 mengandung 0,25 × 50 × 10 = 125 ng/µL dsDNA. Pembacaan paling andal di antara sekitar 0,1 dan 1,0; encerkan sampel yang lebih pekat. Oligo pendek lebih bervariasi menurut komposisi basanya, jadi sebaiknya dihitung dari koefisien ekstingsinya sendiri.

Rasio kemurnian

• A260/280 sekitar 1,8 untuk DNA dan 2,0 untuk RNA. Nilai yang lebih rendah menandakan protein atau fenol.
• A260/230 sekitar 2,0 sampai 2,2. Nilai yang lebih rendah menandakan garam guanidin, EDTA, atau karbohidrat yang tersisa dari proses isolasi.

Dari ng ke jumlah salinan

Untuk standar qPCR Anda perlu jumlah molekul. Satu pasang basa dsDNA berbobot sekitar 618 g/mol, jadi 1 ng plasmid 3.000 bp setara dengan sekitar 3,2 × 10⁸ salinan.

Kalkulator

Kalkulator Konsentrasi DNA mengolah pembacaan dan pengenceran Anda serta memeriksa rasionya. Kalkulator Jumlah Salinan DNA mengonversi antara ng dan salinan. Untuk molekul lain, Kalkulator Hukum Beer-Lambert bekerja dari koefisien ekstingsi.

Menghitung jumlah salinan langkah demi langkah

Salinan = massa dalam gram × 6,022 × 10²³ ÷ (panjang dalam bp × 618). Untuk 1 ng plasmid 3.000 bp: 1 × 10⁻⁹ × 6,022 × 10²³ ÷ (3.000 × 618) = 6,022 × 10¹⁴ ÷ 1.854.000 = 3,25 × 10⁸ salinan. Beberapa protokol memakai 650 g/mol per pasang basa, yang memberi sekitar 5% lebih sedikit.

Memipet jumlah tertentu

Untuk memasukkan 100 ng ke reaksi dari stok 125 ng/µL dibutuhkan 100 ÷ 125 = 0,8 µL, terlalu sedikit untuk dipipet dengan akurat. Encerkan stok 1:10 menjadi 12,5 ng/µL lebih dulu, lalu tambahkan 8 µL.

Masalah umum

• Bacaan DNA terlalu tinggi. RNA juga menyerap pada 260 nm, jadi preparasi DNA yang mengandung RNA terbaca tinggi. Beri perlakuan RNase, atau pakai uji berbasis pewarna yang hanya mendeteksi DNA.
• Rasio 260/280 rendah untuk DNA yang bersih. Air tanpa buffer sedikit asam dan bisa menurunkan rasio 0,2 sampai 0,3. Encerkan dan buat blanko dalam buffer seperti TE.
• Bacaan melompat dari satu tetes ke tetes lain. Campur sampel sebelum mengukur, lap kedua pedestal, dan perhatikan gelembung pada alat mikrovolume.
• Bacaan negatif atau sangat kecil. Blanko memakai buffer yang berbeda dari sampel, atau sampel berada di bawah rentang ukur alat.