A260 से DNA सांद्रता कैसे निकालें

एब्ज़ॉर्बेंस से सांद्रता

न्यूक्लिक एसिड 260 nm पर पराबैंगनी प्रकाश सोखते हैं। 1 cm पाथ के साथ, 1.0 का A260 लगभग इसके बराबर है:

• डबल-स्ट्रैंडेड DNA के 50 ng/µL
• RNA के 40 ng/µL
• सिंगल-स्ट्रैंडेड DNA के 33 ng/µL

सांद्रता = A260 × फ़ैक्टर × डाइल्यूशन। 1:10 पतला किया सैंपल जो 0.25 पढ़ता है, उसमें 0.25 × 50 × 10 = 125 ng/µL dsDNA है। रीडिंग लगभग 0.1 और 1.0 के बीच सबसे भरोसेमंद होती है; गाढ़े सैंपल पतले करें। छोटे ओलिगो बेस की बनावट के साथ ज़्यादा बदलते हैं, इसलिए उन्हें उनके अपने एक्सटिंक्शन कोएफ़िशिएंट से निकालना बेहतर है।

शुद्धता के अनुपात

• A260/280 DNA के लिए लगभग 1.8 और RNA के लिए 2.0। कम मान प्रोटीन या फ़िनॉल की ओर इशारा करते हैं।
• A260/230 लगभग 2.0 से 2.2। कम मान गुआनिडीन सॉल्ट, EDTA या कार्बोहाइड्रेट की ओर इशारा करते हैं जो प्रेप से बचे रह गए।

ng से कॉपी

qPCR स्टैंडर्ड के लिए अणुओं की संख्या चाहिए। dsDNA का एक बेस पेयर लगभग 618 g/mol का होता है, इसलिए 3,000 bp प्लाज़्मिड का 1 ng लगभग 3.2 × 10⁸ कॉपी है।

कैलकुलेटर

DNA सांद्रता कैलकुलेटर आपकी रीडिंग और डाइल्यूशन लेकर अनुपात जाँचता है। DNA प्रति संख्या कैलकुलेटर ng और कॉपी के बीच बदलता है। दूसरे अणुओं के लिए बीयर-लैम्बर्ट नियम कैलकुलेटर एक्सटिंक्शन कोएफ़िशिएंट से काम करता है।

कॉपी संख्या, क़दम-दर-क़दम

कॉपियाँ = ग्राम में द्रव्यमान × 6.022 × 10²³ ÷ (bp में लंबाई × 618)। 3,000 bp के प्लाज़्मिड के 1 ng के लिए: 1 × 10⁻⁹ × 6.022 × 10²³ ÷ (3,000 × 618) = 6.022 × 10¹⁴ ÷ 1,854,000 = 3.25 × 10⁸ कॉपियाँ। कुछ प्रोटोकॉल प्रति बेस पेयर 650 g/mol लेते हैं, जिससे लगभग 5% कम आता है।

तय मात्रा पिपेट करना

125 ng/µL के स्टॉक से रिएक्शन में 100 ng डालने के लिए 100 ÷ 125 = 0.8 µL चाहिए, जो सही-सही पिपेट करने के लिए बहुत कम है। पहले स्टॉक को 1:10 पतला करके 12.5 ng/µL बनाएँ और 8 µL डालें।

आम समस्याएँ

• DNA की रीडिंग बहुत ज़्यादा है। RNA भी 260 nm पर अवशोषित करता है, इसलिए RNA वाली DNA तैयारी ज़्यादा पढ़ती है। RNase से उपचार करें, या ऐसा डाई-आधारित परीक्षण इस्तेमाल करें जो सिर्फ़ DNA पकड़ता है।
• साफ़ DNA पर भी 260/280 अनुपात कम है। बिना बफ़र का पानी हल्का अम्लीय होता है और अनुपात को 0.2 से 0.3 तक घटा सकता है। TE जैसे बफ़र में पतला करें और उसी में ब्लैंक लें।
• हर बूँद पर रीडिंग बदल जाती है। मापने से पहले सैंपल मिलाएँ, दोनों पेडस्टल पोंछें, और माइक्रोवॉल्यूम उपकरणों में बुलबुलों पर नज़र रखें।
• रीडिंग ऋणात्मक या बहुत छोटी है। ब्लैंक का बफ़र सैंपल से अलग था, या सैंपल उपकरण की उपयोगी सीमा से नीचे है।