吸光度から濃度へ
核酸は260 nmの紫外線を吸収します。光路長1 cmで、A260が1.0のときの濃度はおよそ次のとおりです。
- 二本鎖DNA: 50 ng/µL
- RNA: 40 ng/µL
- 一本鎖DNA: 33 ng/µL
濃度 = A260 × 係数 × 希釈倍率です。1:10に希釈して0.25と出た試料には、0.25 × 50 × 10 = 125 ng/µLの二本鎖DNAが含まれます。測定値は0.1〜1.0程度のときが最も信頼でき、濃い試料は希釈して測ります。短いオリゴは塩基組成による差が大きいので、それぞれのモル吸光係数から計算するほうが正確です。
純度の指標
- A260/280はDNAで約1.8、RNAで約2.0。低い場合はタンパク質やフェノールの混入が疑われます。
- A260/230は約2.0〜2.2。低い場合は、精製で残ったグアニジン塩、EDTA、糖類が疑われます。
ngからコピー数へ
qPCRの標準には分子の数が必要です。二本鎖DNAの1塩基対は約618 g/molなので、3,000 bpのプラスミド1 ngは約3.2 × 108コピーです。
計算ツール
DNA 濃度の計算は、測定値と希釈倍率から濃度を出し、純度の比も確認します。DNA コピー数の計算はngとコピー数を換算します。ほかの分子なら、ランベルト・ベールの法則でモル吸光係数から計算できます。