吸光度から濃度へ
核酸は260 nmの紫外線を吸収します。光路長1 cmで、A260が1.0のときの濃度はおよそ次のとおりです。
- 二本鎖DNA: 50 ng/µL
- RNA: 40 ng/µL
- 一本鎖DNA: 33 ng/µL
濃度 = A260 × 係数 × 希釈倍率です。1:10に希釈して0.25と出た試料には、0.25 × 50 × 10 = 125 ng/µLの二本鎖DNAが含まれます。測定値は0.1〜1.0程度のときが最も信頼でき、濃い試料は希釈して測ります。短いオリゴは塩基組成による差が大きいので、それぞれのモル吸光係数から計算するほうが正確です。
純度の指標
- A260/280はDNAで約1.8、RNAで約2.0。低い場合はタンパク質やフェノールの混入が疑われます。
- A260/230は約2.0〜2.2。低い場合は、精製で残ったグアニジン塩、EDTA、糖類が疑われます。
ngからコピー数へ
qPCRの標準には分子の数が必要です。二本鎖DNAの1塩基対は約618 g/molなので、3,000 bpのプラスミド1 ngは約3.2 × 108コピーです。
計算ツール
DNA 濃度の計算は、測定値と希釈倍率から濃度を出し、純度の比も確認します。DNA コピー数の計算はngとコピー数を換算します。ほかの分子なら、ランベルト・ベールの法則でモル吸光係数から計算できます。
コピー数の計算手順
コピー数 = 質量（g）× 6.022 × 1023 ÷（長さ bp × 618）。3,000 bpのプラスミド1 ngなら、1 × 10−9 × 6.022 × 1023 ÷（3,000 × 618）= 6.022 × 1014 ÷ 1,854,000 = 3.25 × 108 コピーです。1塩基対あたり650 g/molを使うプロトコルもあり、その場合は約5%少なくなります。
決まった量をピペットで取る
125 ng/µLのストックから反応に100 ngを入れるには 100 ÷ 125 = 0.8 µL が必要ですが、これは正確にピペッティングするには少なすぎます。先にストックを1:10に希釈して12.5 ng/µLにし、8 µL加えましょう。
よくある問題
- DNAの値が高すぎる。RNAも260 nmで吸収するため、RNAが混じったDNAは高く出ます。RNase処理をするか、DNAだけを検出する蛍光色素法を使ってください。
- きれいなDNAなのに260/280比が低い。緩衝液を含まない水は弱酸性で、比が0.2〜0.3下がることがあります。TEなどの緩衝液で希釈し、ブランクも同じ液で取りましょう。
- 滴ごとに値がばらつく。測定前にサンプルを混ぜ、上下の台座を拭き、微量測定装置では気泡に注意してください。
- 値がマイナス、またはごく小さい。ブランクにサンプルと違う緩衝液を使ったか、サンプルが装置の測定範囲を下回っています。