흡광도에서 농도로
핵산은 260 nm 자외선을 흡수합니다. 광로 길이 1 cm에서 A260이 1.0일 때 농도는 대략 다음과 같습니다.
- 이중 가닥 DNA: 50 ng/µL
- RNA: 40 ng/µL
- 단일 가닥 DNA: 33 ng/µL
농도 = A260 × 계수 × 희석 배수입니다. 1:10으로 희석해 0.25가 나온 시료에는 0.25 × 50 × 10 = 125 ng/µL의 이중 가닥 DNA가 들어 있습니다. 측정값은 0.1~1.0 정도일 때 가장 믿을 만하니, 진한 시료는 희석해서 재세요. 짧은 올리고는 염기 조성에 따른 차이가 커서 각각의 몰 흡광 계수로 계산하는 편이 정확합니다.
순도 지표
- A260/280은 DNA에서 약 1.8, RNA에서 약 2.0. 낮으면 단백질이나 페놀 오염을 의심합니다.
- A260/230은 약 2.0~2.2. 낮으면 정제에서 남은 구아니딘 염, EDTA, 당류를 의심합니다.
ng에서 카피 수로
qPCR 표준에는 분자 수가 필요합니다. 이중 가닥 DNA의 염기쌍 하나는 약 618 g/mol이므로, 3,000 bp 플라스미드 1 ng은 약 3.2 × 108 카피입니다.
계산 도구
DNA 농도 계산기는 측정값과 희석 배수로 농도를 구하고 순도 비율도 확인합니다. DNA 카피 수 계산기는 ng과 카피 수를 환산합니다. 다른 분자라면 비어-람베르트 법칙으로 몰 흡광 계수를 써서 계산할 수 있습니다.
카피 수 계산 단계
카피 수 = 질량(g) × 6.022 × 1023 ÷ (길이 bp × 618). 3,000 bp 플라스미드 1 ng이라면 1 × 10−9 × 6.022 × 1023 ÷ (3,000 × 618) = 6.022 × 1014 ÷ 1,854,000 = 3.25 × 108 카피입니다. 염기쌍당 650 g/mol을 쓰는 프로토콜도 있으며, 그 경우 약 5% 적게 나옵니다.
정해진 양을 피펫팅하기
125 ng/µL 스톡에서 반응에 100 ng을 넣으려면 100 ÷ 125 = 0.8 µL가 필요한데, 정확히 피펫팅하기에는 너무 적습니다. 먼저 스톡을 1:10으로 희석해 12.5 ng/µL로 만들고 8 µL를 넣으세요.
흔한 문제
- DNA 수치가 너무 높다. RNA도 260 nm에서 흡수하므로 RNA가 섞인 DNA는 높게 측정됩니다. RNase 처리를 하거나 DNA만 검출하는 형광 염료 분석을 쓰세요.
- 깨끗한 DNA인데 260/280 비가 낮다. 완충되지 않은 물은 약산성이라 비를 0.2~0.3 낮출 수 있습니다. TE 같은 완충액으로 희석하고 블랭크도 같은 액으로 잡으세요.
- 방울마다 값이 튄다. 측정 전에 시료를 섞고, 위아래 받침대를 닦고, 미량 측정 장비에서는 기포를 확인하세요.
- 음수 또는 아주 작은 값. 블랭크에 시료와 다른 완충액을 썼거나, 시료가 장비의 측정 범위보다 낮습니다.