Как рассчитать концентрацию ДНК по A260

От оптической плотности к концентрации

Нуклеиновые кислоты поглощают ультрафиолет при 260 нм. При длине оптического пути 1 см A260 = 1,0 соответствует примерно:

• 50 нг/мкл двухцепочечной ДНК
• 40 нг/мкл РНК
• 33 нг/мкл одноцепочечной ДНК

Концентрация = A260 × коэффициент × разведение. Образец, разведённый 1:10, с показанием 0,25 содержит 0,25 × 50 × 10 = 125 нг/мкл дцДНК. Показания надёжнее всего примерно между 0,1 и 1,0; более концентрированные образцы разводите. У коротких олигонуклеотидов результат сильнее зависит от нуклеотидного состава, поэтому их лучше считать по собственному коэффициенту экстинкции.

Отношения чистоты

• A260/280 около 1,8 для ДНК и 2,0 для РНК. Более низкие значения указывают на белок или фенол.
• A260/230 около 2,0–2,2. Более низкие значения указывают на соли гуанидина, ЭДТА или углеводы, оставшиеся после выделения.

От нанограммов к копиям

Для стандартов qPCR нужно число молекул. Одна пара нуклеотидов дцДНК весит около 618 г/моль, так что 1 нг плазмиды длиной 3000 п. н. — это около 3,2 × 10⁸ копий.

Калькуляторы

Калькулятор концентрации ДНК принимает ваши показания и разведение и проверяет отношения. Калькулятор числа копий ДНК переводит нанограммы в копии и обратно. Для других молекул Калькулятор закона Бугера — Ламберта — Бера считает по коэффициенту экстинкции.

Расчёт числа копий

Копии = масса в граммах × 6,022 × 10²³ ÷ (длина в п. н. × 618). Для 1 нг плазмиды длиной 3000 п. н.: 1 × 10⁻⁹ × 6,022 × 10²³ ÷ (3000 × 618) = 6,022 × 10¹⁴ ÷ 1 854 000 = 3,25 × 10⁸ копий. В некоторых протоколах берут 650 г/моль на пару оснований, что даёт примерно на 5% меньше.

Пипетирование заданного количества

Чтобы внести в реакцию 100 нг из стока 125 нг/мкл, нужно 100 ÷ 125 = 0,8 мкл, а это слишком мало для точного пипетирования. Сначала разведите сток 1:10 до 12,5 нг/мкл и добавьте 8 мкл.

Частые проблемы

• Показание ДНК завышено. РНК тоже поглощает при 260 нм, поэтому препарат ДНК с примесью РНК даёт завышенное показание. Обработайте РНКазой или используйте флуоресцентный метод с красителем, который видит только ДНК.
• Отношение 260/280 низкое для чистой ДНК. Небуферная вода слегка кислая и может снизить отношение на 0,2–0,3. Разводите и делайте холостую пробу в буфере вроде TE.
• Показания скачут от капли к капле. Перемешайте образец перед измерением, протрите обе площадки и следите за пузырьками в микрообъёмных приборах.
• Отрицательное или крошечное показание. Холостая проба была в другом буфере, чем образец, или образец ниже рабочего диапазона прибора.