Da absorbância à concentração
Os ácidos nucleicos absorvem luz ultravioleta em 260 nm. Com um caminho óptico de 1 cm, uma A260 de 1,0 corresponde a cerca de:
- 50 ng/µL de DNA fita dupla
- 40 ng/µL de RNA
- 33 ng/µL de DNA fita simples
Concentração = A260 × fator × diluição. Uma amostra diluída 1:10 que lê 0,25 contém 0,25 × 50 × 10 = 125 ng/µL de DNA fita dupla. As leituras são mais confiáveis entre cerca de 0,1 e 1,0; dilua as amostras mais fortes. Oligos curtos variam mais com a composição de bases, então é melhor calculá-los pelo seu próprio coeficiente de extinção.
Razões de pureza
- A260/280 em torno de 1,8 para DNA e 2,0 para RNA. Valores menores sugerem proteína ou fenol.
- A260/230 em torno de 2,0 a 2,2. Valores menores sugerem sais de guanidina, EDTA ou carboidratos que sobraram da extração.
De ng para cópias
Para padrões de qPCR você precisa do número de moléculas. Um par de bases de DNA fita dupla pesa cerca de 618 g/mol, então 1 ng de um plasmídeo de 3.000 pb são cerca de 3,2 × 108 cópias.
Calculadoras
A Calculadora de concentração de DNA usa suas leituras e a diluição e confere as razões. A Calculadora de número de cópias de DNA converte entre ng e cópias. Para outras moléculas, a Calculadora da lei de Beer-Lambert trabalha com o coeficiente de extinção.