Como calcular a concentração de DNA a partir da A260

Da absorbância à concentração

Os ácidos nucleicos absorvem luz ultravioleta em 260 nm. Com um caminho óptico de 1 cm, uma A260 de 1,0 corresponde a cerca de:

• 50 ng/µL de DNA fita dupla
• 40 ng/µL de RNA
• 33 ng/µL de DNA fita simples

Concentração = A260 × fator × diluição. Uma amostra diluída 1:10 que lê 0,25 contém 0,25 × 50 × 10 = 125 ng/µL de DNA fita dupla. As leituras são mais confiáveis entre cerca de 0,1 e 1,0; dilua as amostras mais fortes. Oligos curtos variam mais com a composição de bases, então é melhor calculá-los pelo seu próprio coeficiente de extinção.

Razões de pureza

• A260/280 em torno de 1,8 para DNA e 2,0 para RNA. Valores menores sugerem proteína ou fenol.
• A260/230 em torno de 2,0 a 2,2. Valores menores sugerem sais de guanidina, EDTA ou carboidratos que sobraram da extração.

De ng para cópias

Para padrões de qPCR você precisa do número de moléculas. Um par de bases de DNA fita dupla pesa cerca de 618 g/mol, então 1 ng de um plasmídeo de 3.000 pb são cerca de 3,2 × 10⁸ cópias.

Calculadoras

A Calculadora de concentração de DNA usa suas leituras e a diluição e confere as razões. A Calculadora de número de cópias de DNA converte entre ng e cópias. Para outras moléculas, a Calculadora da lei de Beer-Lambert trabalha com o coeficiente de extinção.

O número de cópias passo a passo

Cópias = massa em gramas × 6,022 × 10²³ ÷ (comprimento em pb × 618). Para 1 ng de um plasmídeo de 3.000 pb: 1 × 10⁻⁹ × 6,022 × 10²³ ÷ (3.000 × 618) = 6,022 × 10¹⁴ ÷ 1.854.000 = 3,25 × 10⁸ cópias. Alguns protocolos usam 650 g/mol por par de bases, o que dá cerca de 5% a menos.

Pipetar uma quantidade fixa

Para colocar 100 ng numa reação a partir de um estoque de 125 ng/µL, são precisos 100 ÷ 125 = 0,8 µL, pouco demais para pipetar com precisão. Dilua o estoque 1:10 até 12,5 ng/µL antes e adicione 8 µL.

Problemas comuns

• A leitura de DNA está alta demais. O RNA também absorve em 260 nm, então um preparo de DNA com RNA lê alto. Trate com RNase, ou use um ensaio com corante que só detecta DNA.
• A razão 260/280 está baixa com DNA limpo. Água sem tampão é levemente ácida e pode baixar a razão em 0,2 a 0,3. Dilua e faça o branco num tampão como TE.
• As leituras pulam de uma gota para outra. Misture a amostra antes de medir, limpe os dois pedestais e observe bolhas nos aparelhos de microvolume.
• Uma leitura negativa ou minúscula. O branco usou um tampão diferente do da amostra, ou a amostra está abaixo da faixa útil do aparelho.