De l’absorbance à la concentration
Les acides nucléiques absorbent la lumière ultraviolette à 260 nm. Avec un trajet optique de 1 cm, une A260 de 1,0 correspond à environ :
- 50 ng/µL d’ADN double brin
- 40 ng/µL d’ARN
- 33 ng/µL d’ADN simple brin
Concentration = A260 × facteur × dilution. Un échantillon dilué au 1:10 qui lit 0,25 contient 0,25 × 50 × 10 = 125 ng/µL d’ADN double brin. Les mesures sont les plus fiables entre 0,1 et 1,0 environ ; diluez les échantillons plus concentrés. Les oligos courts varient davantage selon leur composition en bases, il vaut donc mieux les calculer avec leur propre coefficient d’extinction.
Les rapports de pureté
- A260/280 autour de 1,8 pour l’ADN et de 2,0 pour l’ARN. Des valeurs plus basses signalent des protéines ou du phénol.
- A260/230 autour de 2,0 à 2,2. Des valeurs plus basses signalent des sels de guanidine, de l’EDTA ou des glucides restés de la purification.
Des ng aux copies
Pour les gammes étalons de qPCR, il faut le nombre de molécules. Une paire de bases d’ADN double brin pèse environ 618 g/mol : 1 ng d’un plasmide de 3 000 pb représente donc environ 3,2 × 108 copies.
Les outils
Le Calcul de concentration d’ADN prend vos mesures et la dilution et vérifie les rapports. Le Calcul du nombre de copies d’ADN convertit entre ng et copies. Pour les autres molécules, le Calcul de la loi de Beer-Lambert travaille à partir du coefficient d’extinction.
Le nombre de copies pas à pas
Copies = masse en grammes × 6,022 × 1023 ÷ (longueur en pb × 618). Pour 1 ng d’un plasmide de 3 000 pb : 1 × 10−9 × 6,022 × 1023 ÷ (3 000 × 618) = 6,022 × 1014 ÷ 1 854 000 = 3,25 × 108 copies. Certains protocoles utilisent 650 g/mol par paire de bases, ce qui donne environ 5 % de moins.
Pipeter une quantité fixe
Pour mettre 100 ng dans une réaction à partir d’un stock à 125 ng/µL, il faut 100 ÷ 125 = 0,8 µL, trop peu pour pipeter avec précision. Diluez d’abord le stock au 1/10 jusqu’à 12,5 ng/µL et ajoutez 8 µL.
Problèmes fréquents
- La mesure d’ADN est trop haute. L’ARN absorbe aussi à 260 nm, donc une préparation d’ADN contenant de l’ARN donne une valeur trop haute. Traitez à la RNase, ou utilisez un dosage par fluorescence qui ne voit que l’ADN.
- Le rapport 260/280 est bas pour un ADN propre. L’eau non tamponnée est légèrement acide et peut abaisser le rapport de 0,2 à 0,3. Diluez et faites le blanc dans un tampon comme le TE.
- Les mesures varient d’une goutte à l’autre. Mélangez l’échantillon avant de mesurer, essuyez les deux supports et surveillez les bulles sur les appareils à microvolume.
- Une mesure négative ou minuscule. Le blanc a été fait avec un autre tampon que l’échantillon, ou l’échantillon est sous la plage utile de l’appareil.