DNA-Konzentration aus der A260 berechnen

Von der Absorption zur Konzentration

Nukleinsäuren absorbieren UV-Licht bei 260 nm. Bei 1 cm Schichtdicke entspricht eine A260 von 1,0 etwa:

• 50 ng/µL doppelsträngiger DNA
• 40 ng/µL RNA
• 33 ng/µL einzelsträngiger DNA

Konzentration = A260 × Faktor × Verdünnung. Eine 1:10 verdünnte Probe mit 0,25 enthält 0,25 × 50 × 10 = 125 ng/µL dsDNA. Am verlässlichsten sind Messwerte zwischen etwa 0,1 und 1,0; stärkere Proben verdünnen. Kurze Oligos schwanken stärker mit ihrer Basenzusammensetzung und werden besser über ihren eigenen Extinktionskoeffizienten berechnet.

Reinheitsverhältnisse

• A260/280 um 1,8 bei DNA und 2,0 bei RNA. Niedrigere Werte deuten auf Protein oder Phenol hin.
• A260/230 um 2,0 bis 2,2. Niedrigere Werte deuten auf Guanidinsalze, EDTA oder Kohlenhydrate aus der Aufreinigung hin.

Von ng zu Kopien

Für qPCR-Standards braucht man die Zahl der Moleküle. Ein Basenpaar dsDNA wiegt etwa 618 g/mol, 1 ng eines Plasmids mit 3.000 bp sind also etwa 3,2 × 10⁸ Kopien.

Rechner

Der DNA-Konzentrationsrechner nimmt die Messwerte und die Verdünnung und prüft die Verhältnisse. Der DNA-Kopienzahl-Rechner rechnet zwischen ng und Kopien um. Für andere Moleküle arbeitet der Rechner für das Lambert-Beer-Gesetz mit dem Extinktionskoeffizienten.

Die Kopienzahl Schritt für Schritt

Kopien = Masse in Gramm × 6,022 × 10²³ ÷ (Länge in bp × 618). Für 1 ng eines 3.000-bp-Plasmids: 1 × 10⁻⁹ × 6,022 × 10²³ ÷ (3.000 × 618) = 6,022 × 10¹⁴ ÷ 1.854.000 = 3,25 × 10⁸ Kopien. Manche Protokolle rechnen mit 650 g/mol pro Basenpaar, was etwa 5 % weniger ergibt.

Eine feste Menge pipettieren

Um 100 ng aus einem Stock mit 125 ng/µL in eine Reaktion zu geben, brauchst du 100 ÷ 125 = 0,8 µL, zu wenig für genaues Pipettieren. Verdünne den Stock vorher 1:10 auf 12,5 ng/µL und gib 8 µL dazu.

Häufige Probleme

• Der DNA-Wert ist zu hoch. RNA absorbiert ebenfalls bei 260 nm, eine DNA-Präparation mit RNA misst also zu hoch. Behandle mit RNase, oder nutze einen Farbstoff-Assay, der nur DNA erfasst.
• Das 260/280-Verhältnis ist bei sauberer DNA niedrig. Ungepuffertes Wasser ist leicht sauer und kann das Verhältnis um 0,2 bis 0,3 senken. Verdünne und miss den Leerwert in einem Puffer wie TE.
• Die Werte springen von Tropfen zu Tropfen. Mische die Probe vor dem Messen, wische beide Sockel ab und achte bei Mikrovolumengeräten auf Blasen.
• Ein negativer oder winziger Wert. Der Leerwert wurde mit einem anderen Puffer als die Probe gemessen, oder die Probe liegt unter dem Messbereich des Geräts.