Von der Absorption zur Konzentration
Nukleinsäuren absorbieren UV-Licht bei 260 nm. Bei 1 cm Schichtdicke entspricht eine A260 von 1,0 etwa:
- 50 ng/µL doppelsträngiger DNA
- 40 ng/µL RNA
- 33 ng/µL einzelsträngiger DNA
Konzentration = A260 × Faktor × Verdünnung. Eine 1:10 verdünnte Probe mit 0,25 enthält 0,25 × 50 × 10 = 125 ng/µL dsDNA. Am verlässlichsten sind Messwerte zwischen etwa 0,1 und 1,0; stärkere Proben verdünnen. Kurze Oligos schwanken stärker mit ihrer Basenzusammensetzung und werden besser über ihren eigenen Extinktionskoeffizienten berechnet.
Reinheitsverhältnisse
- A260/280 um 1,8 bei DNA und 2,0 bei RNA. Niedrigere Werte deuten auf Protein oder Phenol hin.
- A260/230 um 2,0 bis 2,2. Niedrigere Werte deuten auf Guanidinsalze, EDTA oder Kohlenhydrate aus der Aufreinigung hin.
Von ng zu Kopien
Für qPCR-Standards braucht man die Zahl der Moleküle. Ein Basenpaar dsDNA wiegt etwa 618 g/mol, 1 ng eines Plasmids mit 3.000 bp sind also etwa 3,2 × 108 Kopien.
Rechner
Der DNA-Konzentrationsrechner nimmt die Messwerte und die Verdünnung und prüft die Verhältnisse. Der DNA-Kopienzahl-Rechner rechnet zwischen ng und Kopien um. Für andere Moleküle arbeitet der Rechner für das Lambert-Beer-Gesetz mit dem Extinktionskoeffizienten.