Warum ein molares Verhältnis
Die Ligation hängt von der Zahl der DNA-Enden ab, nicht von der Masse. Ein kleines Insert hat pro ng viel mehr Moleküle als ein großer Vektor, gleiche Massen ergäben also sehr ungleiche Molekülzahlen. Protokolle geben daher ein molares Verhältnis von Insert zu Vektor an, meist 3:1.
Die Formel
Insert (ng) = Vektor (ng) × Insertlänge ÷ Vektorlänge × Verhältnis
Mit 50 ng eines Vektors von 3.000 bp und einem Insert von 1.000 bp bei 3:1: 50 × 1.000 ÷ 3.000 × 3 = 50 ng Insert.
Tipps
- 1:1, 3:1 und 5:1 ausprobieren, wenn der erste Versuch wenige Kolonien bringt.
- Sehr kurze Inserts wie hybridisierte Oligos brauchen oft höhere Verhältnisse.
- Eine Ligation nur mit Vektor als Kontrolle für den Hintergrund aus ungeschnittenem oder religiertem Vektor mitlaufen lassen.
- Konzentrationen nach der Aufreinigung messen, nicht davor.
Rechner
Der Ligationsrechner gibt die ng Insert für jedes Verhältnis an und mit der Insertkonzentration das zu pipettierende Volumen. Diese Konzentration misst man mit dem DNA-Konzentrationsrechner.
Ein Beispiel mit Volumina
Nach dem Beispiel oben brauchst du 50 ng Vektor und 50 ng Insert. Liegt der Vektor bei 50 ng/µl und das Insert bei 25 ng/µl:
- Vektor: 50 ÷ 50 = 1 µl.
- Insert: 50 ÷ 25 = 2 µl.
- 10× Ligasepuffer: 2 µl. T4-DNA-Ligase: 1 µl.
- Wasser auf 20 µl: 14 µl.
Die Kontrolle in Mol
Ein Basenpaar doppelsträngiger DNA wiegt etwa 650 g/mol, also gilt pmol = ng × 1.000 ÷ (bp × 650). Der Vektor ergibt 50.000 ÷ (3.000 × 650) ≈ 0,026 pmol, das Insert 50.000 ÷ (1.000 × 650) ≈ 0,077 pmol, das Dreifache.
Wenige oder keine Kolonien
- Das ATP im Ligasepuffer zerfällt bei wiederholtem Einfrieren und Auftauen. Bewahre den Puffer in kleinen Aliquots auf.
- Glatte Enden ligieren viel schlechter als überhängende; nimm mehr Ligase und eine längere Inkubation.
- Ein dephosphorylierter Vektor braucht ein Insert, das seine 5′-Phosphate noch hat; PCR-Produkte mit gewöhnlichen Primern haben keine.