Warum ein molares Verhältnis
Die Ligation hängt von der Zahl der DNA-Enden ab, nicht von der Masse. Ein kleines Insert hat pro ng viel mehr Moleküle als ein großer Vektor, gleiche Massen ergäben also sehr ungleiche Molekülzahlen. Protokolle geben daher ein molares Verhältnis von Insert zu Vektor an, meist 3:1.
Die Formel
Insert (ng) = Vektor (ng) × Insertlänge ÷ Vektorlänge × Verhältnis
Mit 50 ng eines Vektors von 3.000 bp und einem Insert von 1.000 bp bei 3:1: 50 × 1.000 ÷ 3.000 × 3 = 50 ng Insert.
Tipps
- 1:1, 3:1 und 5:1 ausprobieren, wenn der erste Versuch wenige Kolonien bringt.
- Sehr kurze Inserts wie hybridisierte Oligos brauchen oft höhere Verhältnisse.
- Eine Ligation nur mit Vektor als Kontrolle für den Hintergrund aus ungeschnittenem oder religiertem Vektor mitlaufen lassen.
- Konzentrationen nach der Aufreinigung messen, nicht davor.
Rechner
Der Ligationsrechner gibt die ng Insert für jedes Verhältnis an und mit der Insertkonzentration das zu pipettierende Volumen. Diese Konzentration misst man mit dem DNA-Konzentrationsrechner.