Neden molar oran kullanılır
Ligasyon DNA uçlarının kütlesine değil sayısına bağlıdır. Küçük bir insertin ng başına büyük bir vektörden çok daha fazla molekülü vardır; bu yüzden eşit kütleler çok eşitsiz molekül sayıları verirdi. Bu nedenle protokoller insertin vektöre molar oranını, çoğu zaman 3:1’i verir.
Formül
insert (ng) = vektör (ng) × insert uzunluğu ÷ vektör uzunluğu × oran
3.000 bp’lik bir vektörün 50 ng’si ve 3:1’de 1.000 bp’lik bir insertle: 50 × 1.000 ÷ 3.000 × 3 = 50 ng insert.
İpuçları
- İlk deneme az koloni verirse 1:1, 3:1 ve 5:1’i dene.
- Birbirine bağlanmış oligolar gibi çok kısa insertler çoğu zaman daha yüksek oranlar ister.
- Kesilmemiş ya da kendine bağlanmış vektörden gelen arka plan için kontrol olarak yalnızca vektörlü bir ligasyon ekle.
- Derişimleri saflaştırmadan önce değil sonra ölç.
Hesaplayıcı
Ligasyon hesaplayıcı her oran için insertin ng’sini ve insert derişimiyle pipetlenecek hacmi verir. O derişimi DNA derişimi hesaplayıcı ile ölç.
Hacimlerle çözümlü bir örnek
Yukarıdaki örnekten 50 ng vektör ve 50 ng eklenti gerekiyor. Vektör 50 ng/µL ve eklenti 25 ng/µL ise:
- Vektör: 50 ÷ 50 = 1 µL.
- Eklenti: 50 ÷ 25 = 2 µL.
- 10× ligaz tamponu: 2 µL. T4 DNA ligaz: 1 µL.
- 20 µL’ye tamamlamak için su: 14 µL.
Mol cinsinden kontrol etmek
Çift iplikli DNA’nın bir baz çifti yaklaşık 650 g/mol gelir; yani pmol = ng × 1.000 ÷ (bp × 650). Vektör 50.000 ÷ (3.000 × 650) ≈ 0,026 pmol, eklenti de üç katı olan 50.000 ÷ (1.000 × 650) ≈ 0,077 pmol’dür.
Az ya da hiç koloni yok
- Ligaz tamponundaki ATP tekrarlanan dondurma ve çözdürmeyle bozunur. Tamponu küçük alikotlar halinde tut.
- Kör uçlar yapışkan uçlardan çok daha güç ligasyona girer; daha fazla ligaz ve daha uzun bir inkübasyon kullan.
- Defosforillenmiş bir vektör, 5′ fosfatları hâlâ duran bir eklenti ister; sıradan primerlerle yapılan PCR ürünlerinde bunlar yoktur.