Formül
canlılık (%) = canlı hücre ÷ (canlı hücre + ölü hücre) × 100
Canlı ve ölü hücreleri aynı karelerde say; böylece seyreltme ve hazne hacmi sadeleşir. Canlılık bir orandır ve mL başına hücreye çevrilmesi gerekmez.
Tripan mavisi nasıl çalışır
Tripan mavisi sağlam bir hücre zarını geçemez. Canlı hücreler onu dışlar ve mikroskop altında parlak kalır; zarı hasarlı ölü hücreler onu alır ve maviye döner. Hücreleri ve %0,4 tripan mavisini 1:1 karıştır, birkaç dakikadan fazla bekleme ve say: boya toksiktir ve yaklaşık 5 dakika sonra canlı hücreler de boyanmaya başlar; bu da canlılığı olduğundan kötü gösterir.
Çözümlü bir örnek
Dört büyük kare 58, 62, 55 ve 61 canlı (ortalama 59) ve 6, 8, 5 ve 9 ölü (ortalama 7) sayımı veriyor.
- Canlılık = 59 ÷ (59 + 7) × 100 = %89.
- mL başına canlı hücre = 59 × 2 (tripan mavisi seyreltmesi) × 104 = 1,18 × 106.
Ne kadar ekeceğini hesaplarken toplamı değil, canlı sayımını kullan.
Kabul edilebilir olan
Log fazındaki sağlıklı kültürlerde canlılık %90’ın üstündedir ve çoğu deney en az %85 ila 90 ister. Yeni çözdürülmüş hücreler %60 ila 80 olabilir ve bir pasajdan sonra toparlanır. Tripsinle kaldırılan hücreler yüzde birkaç kaybeder; tripsinde çok uzun bırakılan, sertçe pipetlenen ya da bir saat buzda tutulan hücreler daha fazla kaybeder. Pasajlar arasında canlılığın düşmesi kontaminasyonun, tükenmiş besiyerinin ya da inkübatörde bir sorunun erken bir işaretidir.
Yaygın hatalar
- Döküntüyü ve boyanmış parçaları ölü hücre saymak sayıyı düşürür; soluk, şişmiş hücreleri canlı saymak yükseltir.
- Ölü hücreler kültürde parçalanıp kaybolur; yani bir canlılık sayımı yalnızca son zamanlardaki ölümü gösterir, ölen her şeyi değil.
- Tripan mavisi, boyayı hâlâ dışlayan erken apoptozdaki hücreleri kaçırır; bu önemli olduğunda akış sitometrisiyle anneksin V ya da propidyum iyodür gibi bir boya kullan.
Hesaplayıcılar
Hemositometre hesaplayıcı canlı ve ölü sayımlarını alır ve canlılığı ve mL başına canlı hücreyi verir. Hücre ekim hesaplayıcı ne kadar pipetleyeceğini hesaplar, Hücre ikilenme süresi hesaplayıcı da pasajlar arasında büyümeyi izler.