फ़ॉर्मूला
वायबिलिटी (%) = जीवित कोशिकाएँ ÷ (जीवित कोशिकाएँ + मृत कोशिकाएँ) × 100
जीवित और मृत कोशिकाएँ एक ही वर्गों में गिनें, ताकि डाइल्यूशन और चैंबर का आयतन कट जाएँ; वायबिलिटी एक अनुपात है और इसे सेल प्रति mL में बदलने की ज़रूरत नहीं।
ट्रिपैन ब्लू कैसे काम करता है
ट्रिपैन ब्लू अक्षुण्ण कोशिका झिल्ली को पार नहीं कर सकता। जीवित कोशिकाएँ इसे बाहर रखती हैं और माइक्रोस्कोप में चमकदार दिखती हैं; क्षतिग्रस्त झिल्ली वाली मृत कोशिकाएँ इसे सोखकर नीली हो जाती हैं। कोशिकाओं और 0.4% ट्रिपैन ब्लू को 1:1 मिलाएँ, कुछ मिनट से ज़्यादा न रुकें, और गिनें: रंजक विषैला है, और लगभग 5 मिनट बाद जीवित कोशिकाएँ भी रंगने लगती हैं, जिससे वायबिलिटी असल से बदतर दिखती है।
हल किया उदाहरण
चार बड़े वर्गों में जीवित गिनती 58, 62, 55 और 61 (औसत 59) और मृत गिनती 6, 8, 5 और 9 (औसत 7) मिली।
- वायबिलिटी = 59 ÷ (59 + 7) × 100 = 89%।
- जीवित सेल प्रति mL = 59 × 2 (ट्रिपैन ब्लू डाइल्यूशन) × 104 = 1.18 × 106।
सीड करने की मात्रा निकालते समय कुल नहीं, जीवित गिनती का इस्तेमाल करें।
कितना स्वीकार्य है
लॉग फ़ेज़ में स्वस्थ कल्चर 90% से ऊपर वायबल होते हैं, और ज़्यादातर प्रयोग कम से कम 85 से 90% चाहते हैं। ताज़ा पिघलाई कोशिकाएँ 60 से 80% हो सकती हैं और एक पैसेज के बाद सुधर जाती हैं। ट्रिप्सिन से छुड़ाई कोशिकाएँ कुछ प्रतिशत खोती हैं; ट्रिप्सिन में बहुत देर रखी, रूखेपन से पिपेट की गई या घंटे भर बर्फ़ पर रखी कोशिकाएँ ज़्यादा खोती हैं। पैसेज के बीच वायबिलिटी गिरना संदूषण, ख़त्म हो चुके मीडियम या इनक्यूबेटर की समस्या का शुरुआती संकेत है।
आम ग़लतियाँ
- मलबे और रंगे टुकड़ों को मृत कोशिकाएँ गिनना अंक घटाता है; धुँधली, फूली कोशिकाओं को जीवित गिनना अंक बढ़ाता है।
- मृत कोशिकाएँ कल्चर में लाइस होकर गायब हो जाती हैं, इसलिए वायबिलिटी गिनती सिर्फ़ हाल की मौत दिखाती है, सब कुछ नहीं जो मरा।
- ट्रिपैन ब्लू शुरुआती एपोप्टोसिस वाली कोशिकाएँ छोड़ देता है, जो अभी रंजक को बाहर रखती हैं; जब यह मायने रखे, फ़्लो साइटोमेट्री के साथ एनेक्सिन V या प्रोपिडियम आयोडाइड जैसा रंजक इस्तेमाल करें।
कैलकुलेटर
हीमोसाइटोमीटर कैलकुलेटर जीवित और मृत गिनतियाँ लेकर वायबिलिटी और जीवित सेल प्रति mL देता है। कोशिका सीडिंग कैलकुलेटर बताता है कितना पिपेट करना है, और कोशिका दोहरीकरण समय कैलकुलेटर पैसेज के बीच वृद्धि पर नज़र रखता है।