प्रोटीन 280 nm पर क्यों सोखते हैं
ट्रिप्टोफ़ैन और टायरोसीन 280 nm पर पराबैंगनी प्रकाश सोखते हैं, और डाइसल्फ़ाइड बंध थोड़ा जोड़ते हैं। हर प्रोटीन में इनकी मात्रा अलग होती है, इसलिए हर प्रोटीन का अपना विलोपन गुणांक होता है, और A280 रीडिंग उतनी ही अच्छी है जितना इस्तेमाल किया गया गुणांक।
सूत्र
बीयर-लैम्बर्ट नियम से सांद्रता (M) = A280 ÷ (ε × पथ लंबाई), जहाँ ε M−1 cm−1 में मोलर विलोपन गुणांक है। mg/mL के लिए आणविक भार से गुणा करें। एक छोटा रास्ता Abs 0.1% है, यानी 1 mg/mL घोल का अवशोषण, जो ε ÷ आणविक भार है: mg/mL = A280 ÷ Abs 0.1%।
अनुक्रम से विलोपन गुणांक
Pace और साथियों (1995) की विधि सोखने वाले अवशेष गिनती है:
ε = 5,500 × Trp + 1,490 × Tyr + 125 × सिस्टीन जोड़ियाँ
सिस्टीन जोड़ी (सिस्टीन) दो सिस्टीन हैं जो डाइसल्फ़ाइड बंध से जुड़े हों; अपचयित प्रोटीन के लिए यह पद हटा दें।
एक उदाहरण
बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन का ε = 43,824 M−1 cm−1 और आणविक भार 66,430 Da है, इसलिए इसका Abs 0.1% = 43,824 ÷ 66,430 = 0.66 है। 1 cm क्यूवेट में 0.33 की रीडिंग का मतलब 0.33 ÷ 0.66 = 0.5 mg/mL, यानी 7.5 µM है।
आम गलतियाँ
- उसी बफ़र से ब्लैंक लें जिसमें प्रोटीन है; इमिडाज़ोल, डिटर्जेंट और कुछ अपचायक 280 nm पर सोखते हैं।
- न्यूक्लिक अम्ल की मिलावट A280 बढ़ाती है। शुद्ध प्रोटीन का A260/A280 अनुपात लगभग 0.6 होता है; 1 के आसपास या ज़्यादा मान DNA या RNA का संकेत है।
- गुच्छे प्रकाश बिखेरते हैं और रीडिंग ज़्यादा आती है। धुंधले नमूनों को सेंट्रीफ़्यूज या फ़िल्टर करें।
- रीडिंग लगभग 0.1 और 1.0 के बीच रखें, ज़रूरत हो तो पतला करें।
- जिन प्रोटीनों में न ट्रिप्टोफ़ैन है न टायरोसीन, वे इस तरह नहीं मापे जा सकते; Bradford या BCA परीक्षण करें।
कैलकुलेटर
प्रोटीन सांद्रता कैलकुलेटर चिपकाए गए अनुक्रम से विलोपन गुणांक निकालता है, या ज्ञात गुणांक या Abs 0.1% लेता है, और mg/mL व µM देता है। बीयर-लैम्बर्ट नियम कैलकुलेटर सामान्य समीकरण हल करता है, और प्रोटीन आणविक भार अनुक्रम से द्रव्यमान देता है।