ΔΔCt से qPCR गुना परिवर्तन कैसे निकालें

आपको क्या चाहिए

एक लक्ष्य जीन और एक संदर्भ जीन (GAPDH या ACTB जैसा हाउसकीपिंग जीन, जिसकी अभिव्यक्ति उपचार से नहीं बदलती) के Ct मान, जो एक उपचारित और एक नियंत्रण नमूने में मापे गए हों।

तीन चरण

1. हर नमूने को संदर्भ जीन से सामान्य करें: ΔCt = लक्ष्य Ct − संदर्भ Ct।
2. उपचारित की तुलना नियंत्रण से करें: ΔΔCt = उपचारित ΔCt − नियंत्रण ΔCt।
3. गुना परिवर्तन में बदलें: गुना परिवर्तन = 2^−ΔΔCt।

एक उदाहरण

उपचारित: लक्ष्य Ct 22.1, संदर्भ Ct 18.0, इसलिए ΔCt = 4.1। नियंत्रण: लक्ष्य Ct 24.5, संदर्भ Ct 18.0, इसलिए ΔCt = 6.5।

ΔΔCt = 4.1 − 6.5 = −2.4, और गुना परिवर्तन = 2^2.4 = 5.3। उपचारित नमूने में लक्ष्य लगभग 5.3 गुना अधिक अभिव्यक्त होता है। 1 से कम गुना परिवर्तन का मतलब कम अभिव्यक्ति है; 0.5 आधा है।

जब 2^-ΔΔCt काफ़ी नहीं होता

यह विधि मानती है कि दोनों प्राइमर जोड़ियों की दक्षता लगभग 100% है, यानी हर चक्र में उत्पाद दोगुना होता है। इसे स्टैंडर्ड कर्व से जाँचें; सामान्य सीमा 90% से 110% है। अगर दक्षताएँ अलग हों, तो Pfaffl विधि इस्तेमाल करें, जिसमें हर जीन की अपनी दक्षता जुड़ती है: अनुपात = E_{लक्ष्य}^{ΔCt लक्ष्य} ÷ E_{संदर्भ}^{ΔCt संदर्भ}, जहाँ हर ΔCt नियंत्रण घटा उपचारित है और E = 1 + दक्षता।

प्रतिकृतियाँ और सांख्यिकी

• ΔCt निकालने से पहले तकनीकी प्रतिकृतियों (एक ही नमूने के वेल) का औसत लें।
• सांख्यिकी जैविक प्रतिकृतियों के ΔCt या ΔΔCt मानों पर करें, गुना परिवर्तन पर नहीं, क्योंकि गुना परिवर्तन सामान्य वितरण में नहीं होता।
• बढ़ोतरी और कमी को एक ही पैमाने पर दिखाने के लिए log₂ गुना परिवर्तन बताएँ, जो सीधे −ΔΔCt है।

कैलकुलेटर

ΔΔCt कैलकुलेटर प्रतिकृतियों का औसत लेता है, ΔCt, ΔΔCt, गुना परिवर्तन और log₂ गुना परिवर्तन देता है, और प्राइमर दक्षता डालने पर Pfaffl विधि पर चला जाता है। स्टैंडर्ड कर्व के साथ निरपेक्ष मात्रा के लिए DNA कॉपी संख्या कैलकुलेटर हर स्टैंडर्ड की कॉपियाँ निकालता है।