Calculer le facteur de variation en qPCR avec ΔΔCt

Ce qu’il vous faut

Les Ct d’un gène cible et d’un gène de référence (un gène de ménage comme GAPDH ou ACTB, dont l’expression ne change pas avec le traitement), mesurés dans un échantillon traité et un échantillon contrôle.

Les trois étapes

1. Normaliser chaque échantillon par le gène de référence : ΔCt = Ct cible − Ct référence.
2. Comparer le traité au contrôle : ΔΔCt = ΔCt traité − ΔCt contrôle.
3. Convertir en facteur de variation : facteur = 2^−ΔΔCt.

Un exemple

Traité : Ct cible 22,1, Ct référence 18,0, donc ΔCt = 4,1. Contrôle : Ct cible 24,5, Ct référence 18,0, donc ΔCt = 6,5.

ΔΔCt = 4,1 − 6,5 = −2,4, et le facteur = 2^2,4 = 5,3. La cible est environ 5,3 fois plus exprimée dans l’échantillon traité. Un facteur inférieur à 1 signifie une expression plus faible ; 0,5 en est la moitié.

Quand 2^-ΔΔCt ne suffit pas

La méthode suppose que les deux couples d’amorces ont une efficacité proche de 100 %, le produit doublant à chaque cycle. Vérifiez-le avec une courbe étalon ; la plage habituelle va de 90 % à 110 %. Si les efficacités diffèrent, utilisez la méthode de Pfaffl, qui intègre l’efficacité de chaque gène : rapport = E_cible^{ΔCt cible} ÷ E_référence^{ΔCt référence}, où chaque ΔCt vaut contrôle moins traité et E = 1 + efficacité.

Réplicats et statistiques

• Moyennez les réplicats techniques (puits du même échantillon) avant de calculer le ΔCt.
• Faites les statistiques sur les ΔCt ou ΔΔCt des réplicats biologiques, pas sur les facteurs de variation, qui ne suivent pas une loi normale.
• Donnez le log₂ du facteur, qui vaut simplement −ΔΔCt, pour placer hausses et baisses sur la même échelle.

Calculateur

Le calcul ΔΔCt moyenne les réplicats, donne ΔCt, ΔΔCt, le facteur de variation et son log₂, et passe à la méthode de Pfaffl quand vous saisissez les efficacités des amorces. Pour une quantification absolue avec courbe étalon, le calcul du nombre de copies d’ADN donne les copies de chaque standard.