qPCR-Fold-Change mit ΔΔCt berechnen

Was du brauchst

Ct-Werte für ein Zielgen und ein Referenzgen (ein Haushaltsgen wie GAPDH oder ACTB, dessen Expression sich durch die Behandlung nicht ändert), gemessen in einer behandelten Probe und einer Kontrolle.

Die drei Schritte

1. Jede Probe auf das Referenzgen normieren: ΔCt = Ct Ziel − Ct Referenz.
2. Behandelt mit Kontrolle vergleichen: ΔΔCt = ΔCt behandelt − ΔCt Kontrolle.
3. In den Fold-Change umrechnen: Fold-Change = 2^−ΔΔCt.

Ein Rechenbeispiel

Behandelt: Ziel-Ct 22,1, Referenz-Ct 18,0, also ΔCt = 4,1. Kontrolle: Ziel-Ct 24,5, Referenz-Ct 18,0, also ΔCt = 6,5.

ΔΔCt = 4,1 − 6,5 = −2,4, und der Fold-Change = 2^2,4 = 5,3. Das Zielgen wird in der behandelten Probe etwa 5,3-mal stärker exprimiert. Ein Fold-Change unter 1 bedeutet schwächere Expression; 0,5 ist die Hälfte.

Wann 2^-ΔΔCt nicht reicht

Die Methode setzt voraus, dass beide Primerpaare eine Effizienz nahe 100 % haben, das Produkt sich also in jedem Zyklus verdoppelt. Prüfe das mit einer Standardkurve; üblich sind 90 % bis 110 %. Weichen die Effizienzen ab, nimm die Pfaffl-Methode, die die Effizienz jedes Gens einrechnet: Verhältnis = E_Ziel^{ΔCt Ziel} ÷ E_Referenz^{ΔCt Referenz}, wobei jedes ΔCt Kontrolle minus behandelt ist und E = 1 + Effizienz.

Replikate und Statistik

• Mittle technische Replikate (Wells derselben Probe), bevor du ΔCt berechnest.
• Rechne die Statistik mit den ΔCt- oder ΔΔCt-Werten der biologischen Replikate, nicht mit den Fold-Changes, denn diese sind nicht normalverteilt.
• Gib den log₂-Fold-Change an, also einfach −ΔΔCt, wenn Hoch- und Herunterregulation auf derselben Skala erscheinen sollen.

Rechner

Der ΔΔCt-Rechner mittelt Replikate, liefert ΔCt, ΔΔCt, Fold-Change und log₂-Fold-Change und wechselt zur Pfaffl-Methode, sobald du Primereffizienzen eingibst. Für die absolute Quantifizierung mit Standardkurve berechnet der DNA-Kopienzahl-Rechner die Kopien jedes Standards.