Wie Restriktionsenzyme schneiden
Jedes Enzym erkennt eine kurze Sequenz, oft ein Palindrom aus 4 bis 8 Basen, und schneidet darin oder daneben. EcoRI erkennt GAATTC und schneidet auf beiden Strängen zwischen G und A. Übrig bleiben überhängende Enden aus vier Basen, AATT, sogenannte klebrige Enden. EcoRV schneidet GATATC genau in der Mitte und hinterlässt glatte Enden.
Herausfinden, welche Enzyme schneiden
- Die Sequenz in die Restriktionsübersicht einfügen.
- Linear oder zirkulär wählen. Ein Plasmid ist zirkulär.
- Die Liste der Enzyme mit Zahl der Schnitte, Positionen und Fragmentgrößen lesen.
Enzyme, die genau einmal schneiden, eignen sich zum Öffnen eines Plasmids. Bei einem Ring ergeben n Schnitte n Fragmente, bei einem linearen Molekül n + 1.
Die Schnittstellen auf der Sequenz sehen
Die Restriktionskarte druckt die Sequenz mit jeder Schnittstelle darüber markiert. So lässt sich leicht prüfen, ob eine Schnittstelle dort liegt, wo man sie erwartet, oder zwei Enzyme links und rechts eines Gens finden.
Eine Schnittstelle einfügen, ohne das Protein zu ändern
Fehlt eine passende Schnittstelle, können ein oder zwei stille Mutationen manchmal eine erzeugen, während das Protein gleich bleibt. Schnittstelle durch Mutation listet solche Stellen in einer kodierenden Sequenz auf, bereit für eine gerichtete Mutagenese oder für einen Primer.