Restriktionsschnittstellen in einer DNA-Sequenz finden

Wie Restriktionsenzyme schneiden

Jedes Enzym erkennt eine kurze Sequenz, oft ein Palindrom aus 4 bis 8 Basen, und schneidet darin oder daneben. EcoRI erkennt GAATTC und schneidet auf beiden Strängen zwischen G und A. Übrig bleiben überhängende Enden aus vier Basen, AATT, sogenannte klebrige Enden. EcoRV schneidet GATATC genau in der Mitte und hinterlässt glatte Enden.

Herausfinden, welche Enzyme schneiden

1. Die Sequenz in die Restriktionsübersicht einfügen.
2. Linear oder zirkulär wählen. Ein Plasmid ist zirkulär.
3. Die Liste der Enzyme mit Zahl der Schnitte, Positionen und Fragmentgrößen lesen.

Enzyme, die genau einmal schneiden, eignen sich zum Öffnen eines Plasmids. Bei einem Ring ergeben n Schnitte n Fragmente, bei einem linearen Molekül n + 1.

Die Schnittstellen auf der Sequenz sehen

Die Restriktionskarte druckt die Sequenz mit jeder Schnittstelle darüber markiert. So lässt sich leicht prüfen, ob eine Schnittstelle dort liegt, wo man sie erwartet, oder zwei Enzyme links und rechts eines Gens finden.

Eine Schnittstelle einfügen, ohne das Protein zu ändern

Fehlt eine passende Schnittstelle, können ein oder zwei stille Mutationen manchmal eine erzeugen, während das Protein gleich bleibt. Schnittstelle durch Mutation listet solche Stellen in einer kodierenden Sequenz auf, bereit für eine gerichtete Mutagenese oder für einen Primer.

Die Fragmente vorhersagen

Nimm ein 4.000-bp-Plasmid mit einer EcoRI-Stelle an Position 400 und einer BamHI-Stelle an 1.300.

• Zirkulär, mit beiden geschnitten: 1.300 − 400 = 900 bp und 4.000 − 900 = 3.100 bp.
• Zirkulär, nur mit EcoRI geschnitten: Ein Schnitt öffnet den Ring zu einer einzigen Bande von 4.000 bp.
• Dieselbe Sequenz als lineares Molekül, mit beiden geschnitten: 400, 900 und 2.700 bp.

Ungeschnittenes Plasmid läuft im Gel nicht auf seiner wahren Größe: Superspiralisierte DNA läuft meist schneller als die lineare Form, vergleiche also immer mit einer geschnittenen Probe.

Häufige Probleme

• Die Stelle ist da, aber das Enzym schneidet nicht. DNA aus gängigen E.-coli-Stämmen ist durch Dam und Dcm methyliert, was manche Enzyme blockiert, wenn eine Stelle eine methylierte Sequenz überlappt. XbaI und ClaI sind oft betroffen. Vermehre das Plasmid in einem dam⁻ dcm⁻-Stamm, wenn du sie brauchst.
• Es erscheinen zusätzliche Banden. Zu viel Enzym, lange Inkubation oder mehr als 5 % Glycerin im Ansatz können manche Enzyme an ähnlichen Sequenzen schneiden lassen, die sogenannte Star-Aktivität. Halte das Enzymvolumen bei höchstens einem Zehntel des Ansatzes.
• Eine Stelle ganz am Ende eines PCR-Produkts schneidet nicht. Viele Enzyme brauchen ein paar zusätzliche Basen jenseits der Stelle, um zu binden. Setze im Primer 4 bis 6 Basen vor die Stelle.
• Zwei Enzyme brauchen verschiedene Puffer. Sieh in der Doppelverdau-Tabelle des Herstellers nach, oder schneide mit einem Enzym, reinige die DNA und schneide dann mit dem anderen.