Cara enzim restriksi memotong
Setiap enzim mengenali sekuens pendek, sering berupa palindrom 4 sampai 8 basa, lalu memotong di dalam atau di sebelahnya. EcoRI mengenali GAATTC dan memotong di antara G dan A pada kedua untai, meninggalkan ujung AATT empat basa yang menjorok, disebut ujung lengket. EcoRV memotong GATATC tepat di tengah dan meninggalkan ujung tumpul.
Mengetahui enzim mana yang memotong
- Tempel sekuens ke Ringkasan Restriksi.
- Pilih linear atau sirkular. Plasmid itu sirkular.
- Baca daftar enzim, jumlah potongan, posisinya, dan ukuran fragmennya.
Enzim yang memotong sekali saja cocok untuk membuka plasmid. Pada molekul sirkular, n potongan menghasilkan n fragmen; pada molekul linear, n + 1.
Melihat situs pada sekuens
Peta Restriksi mencetak sekuens dengan setiap situs potong ditandai di atasnya, sehingga mudah memastikan suatu situs ada di tempat yang Anda kira, atau menemukan dua enzim di kedua sisi sebuah gen.
Menambahkan situs tanpa mengubah protein
Bila tidak ada situs yang pas, satu atau dua mutasi senyap kadang bisa menciptakannya tanpa mengubah protein. Mutasi untuk Digesti mendaftar tempat-tempat itu pada sekuens pengode, siap untuk mutagenesis terarah atau dimasukkan ke dalam primer.
Memperkirakan fragmen
Ambil plasmid 4.000 bp dengan situs EcoRI di posisi 400 dan situs BamHI di 1.300.
- Sirkular, dipotong keduanya: 1.300 − 400 = 900 bp dan 4.000 − 900 = 3.100 bp.
- Sirkular, dipotong EcoRI saja: satu potongan membuka lingkaran menjadi satu pita 4.000 bp.
- Sekuens yang sama sebagai molekul linear, dipotong keduanya: 400, 900, dan 2.700 bp.
Plasmid yang tidak dipotong tidak bermigrasi sesuai ukuran sebenarnya di gel: DNA superkoil biasanya bergerak lebih cepat daripada bentuk linear, jadi selalu bandingkan dengan sampel yang dipotong.
Masalah umum
- Situsnya ada, tetapi enzim tidak memotong. DNA dari galur E. coli umum dimetilasi oleh Dam dan Dcm, yang menghalangi beberapa enzim jika situsnya tumpang tindih dengan sekuens termetilasi. XbaI dan ClaI sering terdampak. Perbanyak plasmid di galur dam− dcm− jika kamu membutuhkannya.
- Muncul pita tambahan. Enzim terlalu banyak, inkubasi terlalu lama, atau gliserol lebih dari 5% dalam reaksi bisa membuat sebagian enzim memotong sekuens yang mirip, disebut aktivitas bintang. Jaga volume enzim paling banyak sepersepuluh volume reaksi.
- Situs di ujung produk PCR tidak terpotong. Banyak enzim butuh beberapa basa tambahan di luar situs untuk menempel. Tambahkan 4 sampai 6 basa sebelum situs pada primer.
- Dua enzim butuh buffer berbeda. Lihat tabel double digest dari pemasok, atau potong dengan satu enzim, bersihkan DNA, lalu potong dengan enzim lainnya.