كيف تقطع إنزيمات التقييد
يتعرف كل إنزيم على تسلسل قصير، غالبًا متناظر من 4 إلى 8 قواعد، ويقطع داخله أو بجانبه. يتعرف EcoRI على GAATTC ويقطع بين G وA في السلسلتين، تاركًا أطرافًا بارزة من أربع قواعد AATT تسمى الأطراف اللاصقة. ويقطع EcoRV GATATC من المنتصف تمامًا ويترك أطرافًا مستوية.
معرفة الإنزيمات التي تقطع
- الصق التسلسل في ملخص التقييد.
- اختر خطيًا أو دائريًا. البلازميد دائري.
- اقرأ قائمة الإنزيمات، وعدد القطوع، والمواضع، وأحجام القطع.
الإنزيمات التي تقطع مرة واحدة هي التي تصلح لفتح بلازميد. في جزيء دائري، n قطوع تعطي n قطعة؛ وفي جزيء خطي تعطي n + 1.
رؤية المواقع على التسلسل
تطبع خريطة التقييد التسلسل مع كل موقع قطع معلَّم فوقه، فيسهل التحقق من أن موقعًا حيث تظن أو إيجاد إنزيمين على جانبي جين.
إضافة موقع دون تغيير البروتين
إن لم يوجد موقع مناسب، يمكن أحيانًا لطفرة صامتة أو اثنتين إنشاء موقع دون تغيير البروتين. يسرد الطفر من أجل الهضم هذه النقاط في تسلسل مشفِّر، جاهزة لطفر موجَّه أو لتضمينها في بادئة.
التنبؤ بالقطع
خذ بلازميدًا طوله 4,000 bp فيه موقع EcoRI عند الموضع 400 وموقع BamHI عند 1,300.
- دائري، مقطوع بالإنزيمين: 1,300 − 400 = 900 bp و4,000 − 900 = 3,100 bp.
- دائري، مقطوع بـ EcoRI وحده: قطع واحد يفتح الدائرة في شريط واحد طوله 4,000 bp.
- التسلسل نفسه كجزيء خطي، مقطوعًا بالإنزيمين: 400 و900 و2,700 bp.
البلازميد غير المقطوع لا يهاجر في الهلام بحسب حجمه الحقيقي: الـ DNA الفائق الالتفاف يهاجر عادةً أسرع من الصورة الخطية، فقارنه دائمًا بعينة مقطوعة.
مشكلات شائعة
- الموقع موجود لكن الإنزيم لا يقطع. الـ DNA من سلالات E. coli المعتادة ممثيل بـ Dam وDcm، وهذا يمنع بعض الإنزيمات حين يتداخل الموقع مع تسلسل ممثيل. يتأثر XbaI وClaI عادةً. إن احتجتهما، فاستنسخ البلازميد في سلالة dam− dcm−.
- تظهر أشرطة زائدة. الإنزيم الزائد، أو الحضانة الطويلة، أو أكثر من 5% غليسرول في التفاعل قد تجعل بعض الإنزيمات تقطع تسلسلات مشابهة، وهو ما يُسمى النشاط النجمي. أبقِ حجم الإنزيم عُشر التفاعل أو أقل.
- موقع في طرف ناتج PCR لا يُقطع. تحتاج إنزيمات كثيرة بضع قواعد إضافية بعد الموقع لترتبط. أضف من 4 إلى 6 قواعد قبل الموقع في البادئ.
- إنزيمان يحتاجان محلولين منظمين مختلفين. راجع جدول الهضم المزدوج لدى المورّد، أو اقطع بإنزيم، ونظّف الـ DNA، ثم اقطع بالآخر.