الدائرة
ترسم خريطة البلازميد الـ DNA الدائري كحلقة، مرقّمة باتجاه عقارب الساعة بدءًا من الموضع 1 في الأعلى. ويظهر الحجم الكلي في المركز بأزواج القواعد. وتبيّن الأسهم العناصر وسلسلتها: التي تتجه مع عقارب الساعة على السلسلة العليا.
الأجزاء الموجودة في معظمها
- أصل التضاعف (ori): يتيح للبلازميد أن يتنسخ في المضيف. أصول pUC تعطي مئات النسخ في الخلية؛ وp15A وpSC101 أقل.
- واسم الانتقاء: جين مقاومة، مثل AmpR (أمبيسيلين) أو KanR (كانامايسين)، كي لا تنمو إلا الخلايا الحاملة للبلازميد.
- المحفّز: حيث يبدأ التعبير عن الإدخال، مثل T7 أو lac أو CMV أو EF-1α. تحقق من أنه يعمل في مضيفك.
- موقع الاستنساخ المتعدد (MCS): مقطع قصير مليء بمواقع تقييد فريدة لإدخال القطعة.
- الوسوم والمنهيات: وسوم His أو FLAG، ومنهٍ بعد الإدخال.
مواقع التقييد
المواقع الظاهرة على الخريطة هي عادةً الفريدة، التي تقطع البلازميد مرة واحدة فقط. للاستنساخ، اختر موقعين فريدين من MCS لا يقطعان أيضًا داخل الإدخال. يسرد ملخص التقييد الإنزيمات ذات القطع الواحد لأي تسلسل، وتبيّن خريطة التقييد أين تقع.
انظر إلى بلازميدك
الصق ملف GenBank في عارض خرائط البلازميدات لترسم عناصره ومواقعه كخريطة.
التحقق من اتجاه دخول الإدخال
الإدخال المستنسخ في موقع واحد قد يدخل في أي من الاتجاهين. هضم اختباري بإنزيم يقطع مرة في الإدخال، بعيدًا عن المركز، ومرة في الناقل يتيح التمييز بينهما.
خذ ناقلًا طوله 5,000 bp فيه إدخال طوله 1,000 bp عند الموضع 1,000، فيصبح طول البلازميد الجديد 6,000 bp. يقطع إنزيم الاختبار الناقل عند ما صار الآن الموضع 3,000، ويقطع الإدخال على بعد 200 bp من أحد طرفيه.
- في اتجاه: يقع موقع الإدخال عند 1,200 ويعطي قطعًا من 1,800 و4,200 bp.
- في الاتجاه الآخر: يقع موقع الإدخال عند 1,800 ويعطي 1,200 و4,800 bp.
البلازميد بلا إدخال يعطي شريطًا واحدًا طوله 5,000 bp، لأن الإنزيم عندها يقطع مرة واحدة.
مشكلات شائعة
- المواضع لا تطابق خريطة أخرى. قد يبدأ كل مصدر ترقيم البلازميد الدائري من نقطة مختلفة. قارن العناصر لا المواضع المنفردة.
- موقع في الخريطة لا يقطع. تعرض الخرائط عادةً المواقع الفريدة فقط، وبعض الإنزيمات تمنعها المثيلة. تحقق من التسلسل، لا من الرسم وحده.
- عناصر بتسميات خاطئة. الخرائط التي تنتقل من مختبر إلى آخر قد تحمل تعليقات قديمة أو خاطئة. اسلسل الأجزاء الأساسية من البلازميد قبل الاعتماد عليها.