Кольцо
Карта плазмиды рисует кольцевую ДНК в виде кольца с нумерацией по часовой стрелке от позиции 1 вверху. Общий размер в парах нуклеотидов показан в середине. Стрелки показывают элементы и цепь, на которой они расположены: стрелки по часовой стрелке — на верхней цепи.
Части, которые есть у большинства плазмид
- Ориджин репликации (ori): позволяет плазмиде копироваться в клетке-хозяине. Ориджины pUC дают сотни копий на клетку; p15A и pSC101 — меньше.
- Селективный маркер: ген устойчивости, например AmpR (ампициллин) или KanR (канамицин), чтобы росли только клетки с плазмидой.
- Промотор: место начала экспрессии вставки, например T7, lac, CMV или EF-1α. Проверьте, что он работает в вашем хозяине.
- Полилинкер (MCS): короткий участок, плотно набитый уникальными сайтами рестрикции для встраивания вставки.
- Метки и терминаторы: метки His или FLAG и терминатор после вставки.
Сайты рестрикции
Сайты, указанные на карте, обычно уникальные, то есть режут плазмиду только один раз. Для клонирования выберите два уникальных сайта в MCS, которые не режут и внутри вашей вставки. Сводка рестрикции перечисляет однократно режущие ферменты в любой последовательности, а Рестрикционная карта показывает, где они находятся.
Посмотрите свою плазмиду
Вставьте файл GenBank в Просмотр карты плазмиды, чтобы нарисовать его элементы и сайты в виде карты.
Как проверить ориентацию вставки
Вставка, клонированная по одному сайту, может встать в любую сторону. Контрольный гидролиз ферментом, который режет один раз во вставке, не по центру, и один раз в векторе, различает два варианта.
Возьмём вектор длиной 5000 п. н. со вставкой 1000 п. н. в позиции 1000, так что новая плазмида — 6000 п. н. Контрольный фермент режет вектор в том месте, которое теперь стало позицией 3000, а вставку — в 200 п. н. от одного конца.
- Одна ориентация: сайт во вставке приходится на 1200, что даёт фрагменты 1800 и 4200 п. н.
- Другая ориентация: сайт во вставке приходится на 1800, что даёт 1200 и 4800 п. н.
Плазмида без вставки даёт одну полосу 5000 п. н., потому что тогда фермент режет только один раз.
Частые проблемы
- Позиции не совпадают с другой картой. Разные источники начинают нумерацию кольцевой плазмиды с разных точек. Сравнивайте элементы, а не сами позиции.
- Сайт на карте не режется. Карты часто показывают только уникальные сайты, а некоторые ферменты блокируются метилированием. Проверяйте саму последовательность, а не только рисунок.
- Элементы подписаны неверно. Карты, переходящие из лаборатории в лабораторию, могут нести старые или ошибочные аннотации. Секвенируйте ключевые участки плазмиды, прежде чем на них полагаться.