Что нужно гиду
Для распространённой SpCas9 гид — это 20 нуклеотидов, совпадающих с ДНК-мишенью, и сразу за мишенью на той же цепи должен идти PAM NGG. Cas9 режет за 3 нуклеотида до PAM. Сам PAM в гид не входит.
Сайты могут быть на любой цепи: NGG на нижней цепи выглядит как CCN на верхней.
Выбор среди сайтов
- Положение. Для нокаута гена целитесь в ранний экзон, общий для всех транскриптов, чтобы сдвиги рамки нарушили белок. Для точного редактирования разрез должен быть в пределах примерно 10 нуклеотидов от изменения.
- GC-состав 40–80%. Очень низкий GC связывается слабо; очень высокий может слишком легко связываться в других местах.
- Никаких TTTT. Четыре T подряд обрывают транскрипцию с промотора U6, который используют большинство плазмид для гидов.
- G в начале помогает транскрипции с U6; если его нет, многие протоколы добавляют его.
Нецелевые сайты
Гид может резать и сайты, отличающиеся на несколько нуклеотидов, особенно когда несовпадения далеко от PAM. Перед заказом проверьте отобранные гиды по всему геному инструментом полногеномного поиска и выберите те, у которых нет близких совпадений в других местах.
Найдите сайты-кандидаты
Вставьте целевую последовательность в Поиск гидов CRISPR. Он перечисляет все сайты на обеих цепях с позицией, цепью и GC-составом для NGG и других PAM. Используйте Рестрикционная карта, чтобы спланировать проверочную рестрикцию вокруг разреза.
Разбор одного сайта
В последовательности ниже на любой из цепей есть один пригодный сайт — NGG с полными 20 основаниями перед ним:
ATGGCTAGCAAGGAGT TCATCCGTGACCTGAAGTTC TGG TAA- Гид: TCATCCGTGACCTGAAGTTC, основания 17–36.
- PAM: TGG, основания 37–39.
- GC-состав: 10 из 20 оснований, 50%.
- Разрез: между основаниями 33 и 34, за три основания до PAM.
Заказ олигонуклеотидов для клонирования
Многие плазмиды Cas9 принимают гид в виде двух отожжённых олигонуклеотидов с выступающими концами, совпадающими с разрезанным вектором. Гид начинается с T, поэтому для промотора U6 добавляется G:
Прямой: 5′-CACCG TCATCCGTGACCTGAAGTTC-3′
Обратный: 5′-AAAC GAACTTCAGGTCACGGATGA C-3′Обратный олигонуклеотид — обратный комплемент гида, а C на его 3′-конце спаривается с добавленным G.
Частые проблемы
- Слабое редактирование. Гиды сильно различаются по эффективности разрезания. Заказывайте два-три на каждую мишень и оставляйте лучший.
- Отредактированные клетки всё ещё делают белок. Инделы в 3, 6 или 9 оснований сохраняют рамку считывания. Проверяйте несколько клонов и выбирайте гид в экзоне, важном для функции белка.
- Редактирование не видно на геле. Маленькие инделы не меняют размер полосы. Используйте анализ расщепления по несовпадениям, секвенирование продукта ПЦР или сайт рестрикции, разрушаемый разрезом.