Как режут рестриктазы
Каждый фермент узнаёт короткую последовательность, часто палиндром из 4–8 нуклеотидов, и режет внутри неё или рядом. EcoRI узнаёт GAATTC и режет между G и A на обеих цепях, оставляя четырёхнуклеотидные выступы AATT — липкие концы. EcoRV разрезает GATATC ровно посередине, оставляя тупые концы.
Узнать, какие ферменты режут
- Вставьте последовательность в Сводка рестрикции.
- Выберите линейную или кольцевую. Плазмида — кольцевая.
- Прочитайте список ферментов, число разрезов, позиции и размеры фрагментов.
Ферменты, режущие один раз, — те, что нужны, чтобы раскрыть плазмиду. На кольце n разрезов дают n фрагментов; на линейной молекуле — n + 1.
Увидеть сайты на последовательности
Рестрикционная карта печатает последовательность, отмечая над ней каждый сайт разрезания, так что легко проверить, что сайт там, где вы думаете, или найти два фермента по обе стороны гена.
Добавить сайт, не меняя белок
Если удобного сайта нет, одна-две молчащие мутации иногда могут создать его, а белок останется тем же. Мутации для рестрикции перечисляет такие места в кодирующей последовательности — для сайт-направленного мутагенеза или чтобы заложить их в праймер.
Предсказание фрагментов
Возьмём плазмиду длиной 4000 п. н. с сайтом EcoRI в позиции 400 и сайтом BamHI в позиции 1300.
- Кольцевая, разрезанная обоими: 1300 − 400 = 900 п. н. и 4000 − 900 = 3100 п. н.
- Кольцевая, разрезанная только EcoRI: один разрез раскрывает кольцо в одну полосу 4000 п. н.
- Та же последовательность как линейная молекула, разрезанная обоими: 400, 900 и 2700 п. н.
Неразрезанная плазмида идёт в геле не на своём истинном размере: суперскрученная ДНК обычно идёт быстрее линейной формы, поэтому всегда сравнивайте с разрезанным образцом.
Частые проблемы
- Сайт есть, но фермент не режет. ДНК из распространённых штаммов E. coli метилирована Dam и Dcm, что блокирует некоторые ферменты, если сайт перекрывается с метилированной последовательностью. Часто это касается XbaI и ClaI. Если они нужны, выращивайте плазмиду в штамме dam− dcm−.
- Появляются лишние полосы. Избыток фермента, долгая инкубация или больше 5% глицерина в реакции могут заставить некоторые ферменты резать похожие последовательности — это звёздная активность. Держите объём фермента не больше десятой части реакции.
- Сайт на самом конце продукта ПЦР не режется. Многим ферментам для связывания нужно несколько дополнительных оснований за сайтом. Добавьте в праймер 4–6 оснований перед сайтом.
- Двум ферментам нужны разные буферы. Сверьтесь с таблицей двойного гидролиза поставщика или режьте одним ферментом, очистите ДНК, затем режьте другим.