Симулятор гель-электрофореза
Уравнения этой модели
| V | Напряжение V (вольты) | ДНК заряжена отрицательно, поэтому движется от чёрного электрода (−) к красному (+) | |
|---|---|---|---|
| d | расстояние между электродами | 15 см в этой камере; важно поле E, поэтому более длинной камере нужно больше вольт | |
| E | электрическое поле | около 5–8 В/см для стандартного электрофореза | |
| v | скорость полосы | в см в час |
При текущих значениях:
| μ₀ | подвижность ДНК в свободном растворе | 3 × 10⁻⁴ см²/(В·с), одинаковая для любой длины, потому что и заряд, и трение растут с длиной | |
|---|---|---|---|
| L | длина фрагмента (п. н.) | гель — это сито: длинные фрагменты задерживаются сильнее | |
| T | Агароза T (% масса/объём) | у более плотного геля поры меньше: он лучше разделяет малые фрагменты и хуже — большие | |
| L* | длина, при которой гель замедляет движение вдвое | эмпирическая подгонка; выше примерно 20 т. п. н. в 1%-ном геле все фрагменты идут с одной предельной скоростью и сливаются в одну полосу |
При текущих значениях:
| a, b | калибровочная кривая | прямая, подогнанная по полосам маркера; по ней читают размер неизвестной полосы | |
|---|---|---|---|
| R² | насколько хорошо прямая подходит | падает, когда полосы маркера у верха или низа выходят из диапазона, который гель хорошо разделяет |
При текущих значениях:
| σ | ширина полосы | полоса начинается шириной с лунку и расплывается за счёт диффузии; длинный медленный электрофорез даёт более размытые полосы, а джоулев нагрев выше примерно 10 В/см размазывает их ещё сильнее |
|---|
При текущих значениях:
| R | сопротивление буфера | около 1,6 кОм для мини-геля в 1× TAE | |
|---|---|---|---|
| P | мощность нагрева | нагревает гель и буфер: если слишком сильно, гель «улыбается» (средние дорожки убегают вперёд) или плавится |
При текущих значениях:
Как пользоваться симулятором гель-электрофореза
- Дорожка 1 — маркер известных размеров, дорожка 2 — неразрезанная плазмида, дорожка 3 — плазмида, разрезанная один раз, дорожка 4 — плазмида, разрезанная двумя ферментами, дорожка 5 — продукт ПЦР и дорожка 6 — любые введённые вами размеры. Гель запускается сразу: ДНК движется от чёрного электрода к красному, а синие красители бегут впереди.
- Следите за временем электрофореза и фронтом красителя и остановите, когда бромфеноловый синий пройдёт примерно три четверти пути, пока мелкие фрагменты не убежали с конца. Меняйте концентрацию агарозы, чтобы увидеть, как плотный гель разделяет мелкие фрагменты, а разбавленный — крупные; повышайте напряжение, чтобы ускорить электрофорез, а выше примерно 10 В/см смотрите, как полосы размываются и «улыбаются» от нагрева геля.
- Читайте размеры полос под картинкой: симуляция подгоняет прямую логарифма размера от расстояния к полосам маркера и определяет по ней остальные полосы, ставя вопросительный знак там, где полоса вне маркера. График показывает эту калибровочную кривую. Чтобы залить гель, используйте Калькулятор агарозного геля; чтобы определить размеры полос в настоящем геле — Оценку размера полос в геле.
Частые вопросы
Почему ДНК движется через гель?
Её фосфатный остов несёт один отрицательный заряд на основание, поэтому в электрическом поле ДНК движется к положительному электроду. В свободном растворе и заряд, и сопротивление растут с длиной, поэтому все фрагменты двигались бы с одной скоростью; разделяет их сетка агарозы, сильнее задерживающая длинные молекулы, чем короткие.
Почему неразрезанная плазмида даёт больше одной полосы?
Плазмида прямо из клетки в основном сверхспирализована — туго скручена сама на себя, что делает её компактной и позволяет обгонять линейную ДНК той же длины. Плазмиды с разрывом в одной цепи расслабляются в открытое кольцо, которое тащится через гель и отстаёт. Разрезанная один раз плазмида становится одной линейной полосой своей истинной длины.
Какую концентрацию агарозы использовать?
Около 0,7% для фрагментов 5–20 т.п.н., 1% для 0,5–10 т.п.н., 1,5% для 0,2–3 т.п.н. и 2–3% для 50 п.н.–1 т.п.н. В разбавленном геле мелкие фрагменты идут вместе, а в плотном крупные едва в него входят. Выше примерно 20 т.п.н. все фрагменты в обычном геле движутся с одной предельной скоростью и собираются в одну полосу; для них используют пульс-электрофорез.
Насколько точно определение размера полосы по маркеру?
В пределах примерно 5–10%, когда полоса лежит между полосами маркера в середине геля, где логарифм размера почти линейно убывает с расстоянием. Хуже у верха и низа геля и вне диапазона маркера, а сверхспирализованную или надрезанную плазмиду вообще нельзя оценить по линейному маркеру.
Пишет, что WebGL выключен.
Для 3D-вида нужен WebGL, который есть во всех современных браузерах. Он может быть выключен, если в настройках браузера отключено аппаратное ускорение или графический драйвер очень старый. Включите аппаратное ускорение или попробуйте другой браузер.
Загружается ли что-нибудь?
Нет. Симуляцию рисует ваш собственный браузер с помощью WebGL; ничего никуда не отправляется, и после загрузки страницы она работает и офлайн.