Симулятор ПЦР
Уравнения этой модели
| N₀ | Начальное число копий матрицы (как степень 10) | двухцепочечных копий в начале | |
|---|---|---|---|
| E | Эффективность E (доля матриц, копируемых за цикл), % | 90–100% в хорошей реакции; здесь снижается, когда T_a слишком близка к Tm праймеров, и когда в реакции кончаются праймеры и нуклеотиды | |
| n | номер цикла | каждый цикл: денатурация при 95 °C, отжиг при T_a, элонгация при 72 °C | |
| N_n | двухцепочечных копий после n циклов | выходит на уровень около 10¹² копий: плато |
При текущих значениях:
| копии мишени | продукты ровно длины ампликона | первые появляются в цикле 3; до этого новые цепи тянутся за места праймеров (длинные продукты), а их число растёт лишь на 2 за цикл, так что мишень вскоре их значительно превосходит | |
|---|---|---|---|
| длинные продукты | копии с цепью длиннее ампликона | получаются из цепей, проходящих за место праймера; счётчики под картинкой точно следят за каждым видом молекул |
При текущих значениях:
| Tm | температура плавления каждого праймера | базовая формула для праймеров от 14 нуклеотидов; в калькуляторе Tm праймеров есть более точное значение по методу ближайших соседей | |
|---|---|---|---|
| T_a | Температура отжига T_a (°C) | обычно на 3–5 °C ниже меньшей Tm; гораздо выше — праймеры не держатся, гораздо ниже — садятся не туда | |
| f_b | доля праймеров, которые отжигаются | 1 ÷ (1 + e^((T_a − Tm) ÷ 1,5)), простая кривая плавления праймера |
При текущих значениях:
| L | длина ампликона | в парах оснований, включая праймеры |
|---|
При текущих значениях:
Как пользоваться симулятором ПЦР
- Вставьте матрицу и два праймера, оба записанные от 5′ к 3′: прямой — как он выглядит в матрице, обратный — как он выглядит на другой цепи. Симулятор находит, где они связываются, длину ампликона и Tm каждого праймера; подробнее пару праймеров проверьте в Калькуляторе Tm праймеров.
- Следите за каждым циклом крупным планом: при 95 °C две цепи расходятся, при температуре отжига праймеры присоединяются к своим сайтам, а при 72 °C полимераза достраивает новую цепь от каждого. Внизу пробирка заполняется копиями: серые — исходные матрицы, синие — длинные продукты, выходящие за сайты праймеров, зелёные — целевые ампликоны точно нужной длины.
- Задайте температуру отжига, эффективность и число исходных копий и читайте точное число продуктов каждого вида после каждого цикла. График показывает число копий в логарифмическом масштабе, где амплификация — прямая, переходящая в плато. Чтобы узнать, сколько копий в данной массе ДНК, используйте Калькулятор числа копий ДНК и его руководство.
Частые вопросы
Сколько копий делает ПЦР?
Каждый цикл может максимум удвоить ДНК, поэтому n циклов дают до 2ⁿ копий на матрицу: около миллиарда после 30 циклов. Реальные реакции идут с эффективностью 90–100%, N = N₀ (1 + E)ⁿ, и выходят на плато около 10¹² копий, когда заканчиваются праймеры и нуклеотиды.
Почему первые продукты длиннее целевого?
В первом цикле каждый праймер копирует исходную цепь от своего сайта до конца матрицы, потому что ничто не велит полимеразе остановиться. Только когда праймер связывается с одной из этих новых цепей, заканчивающейся на сайте другого праймера, получается цепь ровно целевой длины. Первые двуцепочечные целевые молекулы появляются в цикле 3, а после 30 циклов составляют все продукты, кроме крошечной доли: 2ⁿ − 2n на матрицу против 2n длинных продуктов.
Как выбрать температуру отжига?
Начните на 3–5 °C ниже меньшей Tm из двух праймеров. Слишком горячо — праймеры не удерживаются, и эффективность падает, что симулятор показывает; слишком холодно — они связываются и в частично совпадающих местах, давая лишние полосы в геле. Градиентная ПЦР при нескольких температурах находит лучшую.
Что такое Ct в кПЦР?
В количественной ПЦР флуоресцентный краситель сообщает о ДНК по мере её синтеза, а Ct — цикл, на котором сигнал пересекает заданный порог, как пунктирная линия на графике. Каждое десятикратное увеличение исходной матрицы пересекает порог примерно на 3,3 цикла раньше — так кПЦР измеряет исходное количество. Калькулятор ΔΔCt переводит значения Ct в кратность изменения.
Пишет, что WebGL выключен.
Для 3D-вида нужен WebGL, который есть во всех современных браузерах. Он может быть выключен, если в настройках браузера отключено аппаратное ускорение или графический драйвер очень старый. Включите аппаратное ускорение или попробуйте другой браузер.
Загружается ли что-нибудь?
Нет. Симуляцию рисует ваш собственный браузер с помощью WebGL; ничего никуда не отправляется, и после загрузки страницы она работает и офлайн.