Как приготовить мастер-микс для ПЦР

Зачем мастер-микс

Вносить каждый компонент в каждую пробирку долго, и каждый раз добавляется небольшая ошибка. Мастер-микс объединяет в одной пробирке всё общее для реакций, а затем его раскапывают по пробиркам до внесения матрицы. Каждая реакция получает одинаковую смесь, а малых объёмов приходится отбирать гораздо меньше.

Типичные конечные концентрации

• Буфер: 1× (из стока 10× или 5×).
• dNTP: по 0,2 мМ каждого.
• MgCl₂: 1,5–2,5 мМ, если его ещё нет в буфере.
• Праймеры: по 0,1–0,5 мкМ каждого.
• Taq-полимераза: около 1,25 единицы на реакцию 50 мкл.
• Матрица: от 1 пг до 100 нг в зависимости от источника.

Если инструкция к вашей полимеразе говорит иначе, следуйте ей; у высокоточных ферментов особенно свои рекомендации.

Расчёт объёмов

Для каждого компонента объём на реакцию = конечная концентрация ÷ концентрация стока × объём реакции. В реакции 25 мкл 10× буфера нужно 2,5 мкл, а праймеров 10 мкМ до 0,5 мкМ — по 1,25 мкл каждого. Вода дополняет объём, оставшийся после матрицы.

Умножьте каждый объём на число реакций плюс около 10% запаса, потому что часть жидкости теряется на наконечниках и стенках. На 10 реакций готовьте на 11.

Сборка

1. Разморозьте компоненты на льду, затем коротко перемешайте на вортексе и осадите (но не полимеразу).
2. Сначала добавьте воду, затем буфер, dNTP, MgCl₂ и праймеры.
3. Полимеразу добавьте последней, аккуратно перемешайте пипетированием или постукиванием и осадите.
4. Раскапайте смесь по пробиркам, затем добавьте в каждую матрицу. Поставьте контроль без матрицы с водой вместо неё.

Калькуляторы

Калькулятор мастер-микса для ПЦР рассчитывает все объёмы для любого числа реакций. Проверьте температуру отжига праймеров в Калькулятор Tm праймеров, а стоки праймеров приготовьте с помощью Калькулятор растворения олигонуклеотидов.