Como preparar um master mix de PCR

Por que usar um master mix

Pipetar cada componente em cada tubo é lento e acrescenta um pequeno erro a cada vez. Um master mix junta num tubo tudo o que as reações têm em comum, que depois é dividido entre os tubos antes de entrar o molde. Cada reação recebe o mesmo mix, e você pipeta muito menos volumes pequenos.

Concentrações finais comuns

Tampão: 1× (de um estoque 10× ou 5×).
dNTPs: 0,2 mM de cada.
MgCl₂: 1,5 a 2,5 mM, se o tampão ainda não tiver.
Primers: 0,1 a 0,5 µM cada.
Taq polimerase: cerca de 1,25 unidade por reação de 50 µL.
Molde: de 1 pg a 100 ng, conforme a origem.

Siga o manual da sua polimerase quando for diferente; enzimas de alta fidelidade, em especial, têm recomendações próprias.

Calculando os volumes

Para cada componente, volume por reação = concentração final ÷ concentração do estoque × volume de reação. Numa reação de 25 µL, o tampão 10× precisa de 2,5 µL e cada primer de 10 µM a 0,5 µM, de 1,25 µL. A água completa o volume depois do molde.

Multiplique cada volume pelo número de reações mais cerca de 10%, porque um pouco de líquido se perde nas ponteiras e nas paredes do tubo. Para 10 reações, prepare para 11.

Montando o mix

Descongele os componentes no gelo, agite e centrifugue rapidamente (menos a polimerase).
Adicione primeiro a água, depois o tampão, os dNTPs, o MgCl₂ e os primers.
Adicione a polimerase por último, misture com cuidado pipetando ou dando batidinhas e centrifugue.
Divida o mix entre os tubos e adicione o molde em cada um. Inclua um controle sem molde, com água.

Calculadoras

A calculadora de master mix de PCR calcula todos os volumes para qualquer número de reações. Confira a temperatura de anelamento dos primers com a calculadora de Tm de primers e prepare os estoques com a calculadora de ressuspensão de oligos.

Ferramentas deste guia

Calculadora de master mix de PCR Calculadora de Tm de primers Calculadora de ressuspensão de oligos

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