Préparer un mix PCR

Pourquoi un mix

Pipeter chaque composant dans chaque tube est long et ajoute une petite erreur à chaque fois. Un mix réunit dans un tube tout ce que les réactions ont en commun, puis il est réparti dans les tubes avant d’ajouter la matrice. Chaque réaction reçoit le même mix, et vous pipetez bien moins de petits volumes.

Concentrations finales usuelles

• Tampon : 1× (à partir d’un stock 10× ou 5×).
• dNTP : 0,2 mM chacun.
• MgCl₂ : 1,5 à 2,5 mM, si le tampon n’en contient pas déjà.
• Amorces : 0,1 à 0,5 µM chacune.
• Taq polymérase : environ 1,25 unité par réaction de 50 µL.
• Matrice : 1 pg à 100 ng selon son origine.

Suivez le manuel de votre polymérase s’il diffère ; les enzymes haute fidélité ont leurs propres recommandations.

Calculer les volumes

Pour chaque composant, volume par réaction = concentration finale ÷ concentration du stock × volume réactionnel. Dans une réaction de 25 µL, le tampon 10× demande 2,5 µL et chaque amorce à 10 µM ramenée à 0,5 µM, 1,25 µL. L’eau complète le volume après la matrice.

Multipliez chaque volume par le nombre de réactions plus environ 10 %, car un peu de liquide se perd dans les cônes et sur les parois. Pour 10 réactions, préparez-en 11.

Assembler le mix

1. Décongelez les composants sur glace, vortexez-les et centrifugez brièvement (sauf la polymérase).
2. Mettez d’abord l’eau, puis le tampon, les dNTP, le MgCl₂ et les amorces.
3. Ajoutez la polymérase en dernier, mélangez doucement à la pipette ou d’une pichenette, et centrifugez.
4. Répartissez le mix dans les tubes, puis ajoutez chaque matrice. Prévoyez un témoin sans matrice, avec de l’eau.

Calculateurs

Le calcul de mix PCR donne tous les volumes pour n’importe quel nombre de réactions. Vérifiez la température d’hybridation de vos amorces avec le calcul du Tm d’amorces, et préparez leurs stocks avec le calcul de remise en suspension d’oligos.