Calcul du Tm d’amorces

Comment calculer le Tm d’une amorce

1. Collez l’amorce sens et, si vous l’avez, l’amorce antisens, écrites de 5’ vers 3’.
2. Réglez les concentrations d’amorce, de sodium, de magnésium et de dNTP de votre mélange de PCR.
3. Le Tm de chaque amorce s’affiche avec sa longueur, sa teneur en GC, l’écart entre les deux et une température d’hybridation de départ.

Questions fréquentes

Quelle méthode est utilisée ?

La thermodynamique des plus proches voisins avec les paramètres de SantaLucia (1998). Le magnésium est compté comme du sodium supplémentaire, Na⁺ + 120 × √(Mg²⁺ − dNTP), selon von Ahsen et al. (2001).

Quelle température d’hybridation choisir ?

Un point de départ courant est 5 °C sous le plus bas des deux Tm ; une PCR en gradient trouve la meilleure. Certaines polymérases, comme les enzymes haute fidélité dans leurs propres tampons, ont le calculateur et les règles du fabricant, qui donnent d’autres valeurs.

Quel écart entre les deux Tm ?

Moins d’environ 5 °C, pour que les deux amorces s’hybrident bien à la même température.