プライマー Tm 計算

プライマーの Tm を計算する方法

1. フォワードプライマーと、あればリバースプライマーを 5'→3' の向きで貼り付けます。
2. PCR 反応液のプライマー、ナトリウム、マグネシウム、dNTP の濃度を設定します。
3. 各プライマーの Tm が、長さ、GC 含量、2本の差、アニーリング温度の目安とともに表示されます。

よくある質問

どの方法で計算していますか？

SantaLucia (1998) のパラメータによる最近接塩基対法です。マグネシウムは von Ahsen ら (2001) に従い、Na⁺ + 120 × √(Mg²⁺ − dNTP) としてナトリウムに換算しています。

アニーリング温度は何度にすればよいですか？

2本のうち低いほうの Tm より 5 °C 低い温度がよく使われる出発点で、グラジエント PCR で最適値を探します。高正確性酵素など一部のポリメラーゼは、専用バッファー向けにメーカー独自の Tm 計算法があり、値が異なります。

2本の Tm はどのくらい近ければよいですか？

5 °C 以内が目安です。そうすれば同じアニーリング温度で両方のプライマーがよく結合します。