Primer-Tm-Rechner

So berechnest du die Tm eines Primers

1. Füge den Vorwärtsprimer und, falls vorhanden, den Rückwärtsprimer ein, jeweils 5' nach 3' geschrieben.
2. Stelle die Konzentrationen von Primer, Natrium, Magnesium und dNTPs deines PCR-Ansatzes ein.
3. Die Tm jedes Primers erscheint mit Länge, GC-Gehalt, der Differenz zwischen beiden und einer Annealing-Temperatur zum Start.

Häufige Fragen

Welche Methode wird verwendet?

Nearest-Neighbor-Thermodynamik mit den Parametern von SantaLucia (1998). Magnesium wird nach von Ahsen et al. (2001) als zusätzliches Natrium gezählt: Na⁺ + 120 × √(Mg²⁺ − dNTPs).

Welche Annealing-Temperatur soll ich nehmen?

Ein üblicher Startwert liegt 5 °C unter der niedrigeren der beiden Tm; eine Gradienten-PCR findet die beste. Manche Polymerasen, etwa High-Fidelity-Enzyme in ihren eigenen Puffern, haben einen Tm-Rechner und Regeln des Herstellers, die andere Werte liefern.

Wie nah sollten die beiden Tm beieinander liegen?

Innerhalb von etwa 5 °C, damit beide Primer bei derselben Annealing-Temperatur gut binden.